一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法。
【背景技术】
[0002]大豆过氧化物酶(Soybean peroxidase, SBP)是以血红素为辅基的III类过氧化物酶(EC 1.11.1.7)，SBP是一种由单一肽链与铁卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子与血红素结合构成全酶，含有大约分子量的18%的糖基，其等电点为3.9，在pH 3-8之间活性较高，作用范围可达pH 2-11。辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)是一个阳离子酶，SBP和HRP同属于植物过氧化物酶超家族的III类酶，两者的结构和作用机理有许多相似之处。有研宄表明，SBP的构象稳定性远高于HRP，HRP的解链温度为74°C (pH7.0)，远低于 SBP 的 860C (pH 7.0)，SBP 的结合能为 43.3KJ/mol,而 HRP 只有 17KJ/mol，主要原因是SBP与HRP的血红素键联不同，特别是与血红素相连的氨基酸活性位点不同。此外，SBP有更能暴露于溶剂的血红素边缘(血红素边缘是和底物相互作用的部位)使得SBP比HRP具有更高的催化活性。当使用SBP代替常用的HRP制备生物探针催化鲁米诺-过氧化氢反应用于化学发光检测时，由于HRP是阳离子酶，会与氧化底物自由基产物相互作用而使酶失活，而SBP是阴离子酶，不会因为氧化反应产物作用失活，会产生一个较长时间的化学发光信号。使用SBP代替常用的HRP作为标记酶，在耐热性能、底物作用范围、酸碱稳定性以及制备成本等多项指标上均有明显优势。
[0003]大豆过氧化物酶是从大豆加工副产物大豆皮中提取的一类具有很高活性的酸性同功酶，而大豆皮是制油厂大豆加工的副产物，原料价廉易得，能够用于大批量生产。同时大豆过氧化物酶具有的底物作用范围广、耐热性能高、酸碱稳定性好、PH适用范围宽等优点是同类过氧化物酶不可比拟的，所以采用大豆过氧化物酶代替辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶等过氧化物酶作为标记酶用于生物探针制备具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，采用大豆过氧化物酶为标记酶，解决了现有技术中HRP催化致使鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号持续时间短，发光信号不稳定的问题。
[0005]本发明采用以下技术方案:
[0006]一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，包括如下步骤:
[0007]步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键；
[0008]步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子；
[0009]步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。
[0010]步骤一所述氧化剂包括高碘酸钠，所述高碘酸钠在反应溶液中的浓度为4 - 8mmoL0
[0011]步骤二所述蛋白为甲胎蛋白抗体、人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体、游离雌三醇抗体、抑制素A抗体和链酶亲和素。
[0012]本发明采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，具体包括如下步骤:
[0013]步骤一、取5mg大豆过氧化物酶溶于500 yL PBS中，加入12mg/mL Na14溶液500 4 1^，混匀，置室温避光反应151^11 ;后加入500 μ L，0.1 - 5ν/ν%乙二醇室温反应30min ；利用Na14对大豆过氧化物酶进行氧化，氧化速度极为迅速，加入乙二醇及时阻止了氧化环境对酶活的继续损伤，在一定程度上保持了酶活；
[0014]步骤二、将步骤一得到的溶液均分为五份，依次加入813 μ L、lmg/mL甲胎蛋白抗体(AFP抗体)，188 μ L、lmg/mL抑制素A抗体(InhibinA抗体)，200 μ L、lmg/mL人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体(0-1?^抗体)，100^1^、11^/1^游离雌三醇抗体(uE3抗体)和100uL、5mg/mL链酶亲和素混勾，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4°C透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mL NaBH4溶液100 μ L，混勾，置4°C还原反应2h ;利用NaBH4使碳氮双键变成单键，从而形成稳定的酶-蛋白分子；
[0015]步骤三、步骤二得到的五种溶液中分别加入和溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，1000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4°C透析过夜，重复本步骤中盐析至透析步骤两次；次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶-蛋白结合物，每种溶液中分别加入PBS 500 yL复溶；效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。分别偶联五种蛋白的生物探针可作为标记抗体可以用于酶联免疫吸附抗原的检测。
[0016]本发明方法制备的生物探针所用的发光底物液为1.2mM 3-(1(^ -吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺、0.4mM H2O2以及 50mM pH 8.5 的 Tris-HCL缓冲液组成的混合溶液。
[0017]本发明的有益效果:
[0018]1、本发明使用大豆过氧化物酶代替现有技术中的HRP作为标记酶制备生物探针，一方面此酶的热稳定性比HRP高，发光信号比HRP强，可以持续较长时间的强化学发光，检测灵敏度能够获得大大提高。其次，本发明制备的五种生物探针，可用于多项蛋白的检测，同时由于大豆过氧化物酶原料来源广，价格低廉，其产业化研宄具有广泛的应用前景和重要的意义。
[0019]2、本发明控制高碘酸钠氧化的最佳浓度为4 - 8mmoL，制得的生物探针仅有5%左右的醛化酶(SBP — CH0)发生自身交联，其结合率可以达到95%，酶活性可保留80 - 90%，制得的生物探针与传统的辣根过氧化物酶标记的生物探针相比较，具有更强的化学发光信号和更长的发光时间。
【附图说明】
[0020]图1是本发明方法反应流程示意图。
[0021]图2是实施例2中HRP与SBP两种生物探针发光稳定性的比较。
[0022]图3是实施例3中发光底物液中不加入和加入增强剂发光信号强度的比较。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
[0024]以下实施例涉及的PBS为1mM pH 7.4，lv/v%乙二醇水溶液为含有二次水配制的lv/v%乙二醇水溶液；使用的大豆过氧化物酶购自美国B1-Research Products公司；AFP抗体、InhibinA抗体、β-HCG抗体、uE3抗体购自英国Abcam公司，链酶亲和素购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0025]实施例1采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针
[0026]一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针，反应流程如图1所示，包括如下步骤:
[0027]1、取5mg大豆过氧化物酶溶于500 μ L PBS中，加入新配制的12mg/mL Na14溶液500 μ L，混匀，置室