温避光反应15min ;后加入500 μ L，lv/v%乙二醇室温反应30min ；
[0028]2、将步骤I得到的溶液平均分为五等份，每份中依次加入813 μ L、lmg/mL AFP抗体，188uL、lmg/mL InhibinA 抗体，200uL、lmg/mL β -HCG 抗体，100 μ L、lmg/mL uE3 抗体和100uL、5mg/mL链酶亲和素混勾，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4°C透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mL NaBH4溶液100 μ L，混勾，置4°C还原反应2h ；
[0029]3、步骤2得到的五种溶液中分别加入和溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，轻摇盐析0.5h，1000rpm离心15min，去上清，沉淀以少许PBS溶解，装入透析袋，于大量PBS中4°C透析过夜，重复本步骤中盐析至透析步骤两次；次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶-蛋白结合物，每种溶液中分别加PBS 500 yL复溶；效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶，低温保存。
[0030]实施例2比较HRP与SBP两种生物探针的发光稳定性
[0031]取实施例1制备的SBP标记链酶亲和素的生物探针与商品化的HRP生物探针(HRP生物探针购自上海碧云天生物技术有限公司，型号为A0303)，均分别用PH 7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释2500倍、3000倍、5000倍后加至白色96孔板，每孔加入100 μ L,然后在96孔板内同时加入发光底物液(1.2mM 3-(10;-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺和0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液)，单孔加入100 μ L，设置C⑶曝光时间为lmin，利用C⑶成像立即采集化学发光信号。比较HRP与SBP两种酶发光信号的强度与信号的稳定性，如图2所示(a为稀释2500倍，b为稀释3000倍，c为稀释5000倍)，加入化学发光底物后立刻发生化学发光反应，如图2-A，对于HRP反应迅速发生，并在第3min达到最大值，而后光强度迅速下降；如图2-B，对于SBP发光强度在第7min达到最大，光强下降速度比较缓慢，且化学发光反应发生1min后，化学发光强度可以保持在最大值的93.5%，说明SBP的化学发光信号持续时间更长，信号更稳定。
[0032]实施例3测定制得的生物探针在配制的发光底物液中的信号强度
[0033]取实施例1制备的SBP标记β -HCG抗体的生物探针稀释5000倍后，加至白色96孔板，每孔加入10yL,然后在96孔板内同时加入发光底物液。如图3所示(无酶表示不含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液；增强剂表示含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液；酶表示SBP标记β -HCG抗体的生物探针+不含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液；酶+增强剂表示SBP标记β -HCG抗体的生物探针+含增强剂SPTZ和MORPH的发光底物液)，底物液中同时加入增强剂SPTZ和MORPH时，可使得发光体系的发光强度增强近百倍，检测灵敏度大大提高。可以有效克服辣根过氧化物酶标记获得的发光信号弱，即使加入了增强剂对碘苯酚(PIP)，化学发光信号能够放大，但是衰减迅速的缺点。
[0034]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键； 步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子； 步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。
2.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，步骤一所述氧化剂包括高碘酸钠，所述高碘酸钠在反应溶液中的浓度为4 - 8mmoL。
3.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，步骤二所述蛋白为甲胎蛋白抗体、人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体、游离雌三醇抗体、抑制素A抗体和链酶亲和素。
4.根据权利要求1所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、取5mg大豆过氧化物酶溶于500 μ L PBS中，加入12mg/mL Na14溶液500 μ L，混匀，置室温避光反应15min ;后加入500 μ L，0.1 - 5ν/ν%Ζ二醇室温反应30min ； 步骤二、将步骤一得到的溶液均分为五份，依次加入813 μ L、lmg/mL甲胎蛋白抗体，188 μ L、lmg/mL抑制素A抗体，200 μ L、lmg/mL人绒毛膜促性腺激素β亚基抗体，100 μ L、lmg/mL游离雌三醇抗体和100uL、5mg/mL链酶亲和素混勾，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4°C透析24h，使大豆过氧化物酶和蛋白结合；向五种溶液中依次加入5mg/mLNaBH4溶液100 μ L，混匀，置4°C还原反应2h ； 步骤三、步骤二得到的五种溶液中分别加入和溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，1000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4°C透析过夜，重复本步骤中盐析至透析步骤两次；次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶-蛋白结合物，每种溶液中分别加入PBS 500 μ L复溶；效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。
5.权利要求1-4任一权利要求所述的采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，其特征在于，制备的生物探针所用的发光底物液为1.2mM 3-(10'-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺、0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCL缓冲液组成的混合溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种采用大豆过氧化物酶偶联蛋白分子制备生物探针的方法，包括如下步骤：步骤一、利用氧化剂氧化大豆过氧化物酶中的糖苷键；步骤二、将蛋白与步骤一得到的大豆过氧化物酶反应形成希夫氏碱，形成稳定的酶-蛋白分子；步骤三、提纯步骤二得到的酶-蛋白分子，得到所述生物探针。本发明使用大豆过氧化物酶代替现有技术中的HRP作为标记酶制备生物探针，一方面此酶的热稳定性比HRP高，发光信号比HRP强，可以持续较长时间的强化学发光，检测灵敏度能够获得大大提高。其次，本发明制备的五种生物探针，可用于多项蛋白的检测，同时由于大豆过氧化物酶原料来源广，价格低廉，其产业化研究具有广泛的应用前景和重要的意义。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104597253
【申请号】CN201510053654
【发明人】刘松琴, 赵芳, 卢菊生, 张雪红, 尚秋伟
【申请人】东南大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月2日