检测抗-tnf药物和自身抗体的试验的制作方法
【专利说明】检测抗-TNF药物和自身抗体的试验
[0001] 本申请是中国专利申请201080060442. 5的分案申请，原申请的申请日是2010年 10月26日，发明名称是"检测抗-TNF药物和自身抗体的试验"。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2009年10月26日递交的美国临时申请号61/255, 048,2009年11 月19日递交的美国临时申请号61/262, 877,2010年4月15日递交的美国临时申请号 61/324, 635, 2010年5月17日递交的美国临时申请号61/345, 567, 2010年6月3日递交的 美国临时申请号61/351，269, 2010年10月4日递交的美国临时申请号61/389, 672和2010 年10月15日递交的美国临时专利申请号61/393, 581的优先权，其内容通过引用纳入本文 用于所有目的。
[0004] 发明背景
[0005] 自身免疫疾病是重要和广泛传播的医学难题。例如，类风湿关节炎（RA)是一种影 响到200万以上美国人的自身免疫疾病。RA引起关节慢性炎症且通常为进行性疾病，可能 导致关节破坏和功能残疾。类风湿关节炎的病因未知，但该病的病因学涉及遗传倾向、传染 因子和环境因素。活跃性RA的症状包括疲劳、缺乏食欲、低烧、肌肉关节疼痛和僵硬。还有 在该病突发过程中，由于滑膜炎症，关节经常红肿、疼痛和触痛。此外，由于RA是全身性疾 病，炎症可能影响关节以外的机体器官和区域，包括眼睛和口腔的腺体、肺衬膜、心包膜和 血管。
[0006] 处理RA和其他自身免疫疾病的传统疗法包括采用作用快速的"第一线药物"和作 用较慢的"第二线药物"。第一线药物能减轻疼痛和炎症。这类第一线药物的示例包括可口 服给药或直接注射入组织和关节的阿斯匹林、萘普生、布洛芬、依托度酸和其他非类固醇消 炎药（NSAID)，以及皮质激素。第二线药物能促进疾病缓解，防止关节进行性破坏，也称为改 良疾病抗类风湿药物或DMARD。第二线药物的示例包括：金、氢化氯奎、柳氮磺吡啶，和免疫 抑制剂，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和环孢霉素。然而，这些药物中的许 多有有害的副作用。因此，已在寻找对类风湿关节炎和其他自身免疫失调的其他疗法。
[0007] 肿瘤坏死因子- a (TNF-α )是由许多细胞类型包括单核细胞和巨噬细胞所产生 的一种细胞因子，起初是根据它能诱导某些小鼠肿瘤坏死而鉴定。后来，与恶病质有关的称 为恶液质的因子显示与TNF-α相同。TNF-α在病理生理学上涉及到多种其他人类疾病和 失调，包括休克、败血症、感染、自身免疫病、RA、克罗恩病、移植物排斥和移植物抗宿主病。
[0008] 由于人TNF-a (hTNF-a )在多种人类失调中起有害作用，已设计了治疗策略来抑 制或对抗hTNF-a的活性。具体说，已寻找到能抑制和中和hTNF-a活性的抗体，作为抑制 hTNF-a的工具。一些最早的这类抗体是用hTNF-a免疫小鼠的淋巴细胞制备的杂交瘤所 分泌的小鼠单克隆抗体（mAb)(参见Moeller等人的美国专利号5, 231，024)。虽然这些小 鼠抗-hTNF-a抗体常常显示对hTNF-a有高亲和力能中和hTNF-a的活性，但小鼠抗体给 予人所产生的相关问题，如血清半衰期短、不能触发人类某些效应器的功能和在人体中引 发产生抗小鼠抗体的不良免疫应答（"人抗-小鼠抗体"(HAM)反应）限制了其体内应用。
[0009] 近年来，已采用生物学疗法来治疗自身免疫疾失调如类风湿关节炎。例如，四种 TNF- α抑制剂：嵌合性抗-TNF- a mAb REMICADE? (英夫利昔单抗），TNFR-IgFc融合蛋白 ENBREL? (依那西普），人抗-TNF a mAb HUMIRA? (阿达木单抗）和 PEG化（PEGylated)的 Fab 片段一.CIMZIA? (赛妥珠单抗）已经FDA批准用于治疗类风湿关节炎。CIMZIA?也用 于治疗中等至严重的克罗恩病（⑶）。虽然已证明这些生物治疗剂能成功地治疗类风湿关节 炎和其他自身免疫疾病如CD，但不是所有的治疗对象对这种治疗有反应或反应良好。而且， 给予TNF-α抑制剂可能会诱导对该药物的免疫应答，导致产生自身抗体，如人抗-嵌合抗 体（HACA)、人抗-人源化抗体（HAHA)和人抗-小鼠抗体（HAMA)。这类HACA、HAHA或HAMA 免疫应答可能与免疫治疗TNF-α抑制剂的超敏反应和药代动力学显著改变和生物扰乱相 关，阻碍了用该类药物作进一步治疗。因此，本领域需要检测患者样品中存在抗-TNF-α生 物制剂和/或其自身抗体的试验，以监视TNF-α抑制剂的治疗效果和指导治疗决策。本发 明满足了这种需求并提供相关的效益。
[0010] 发明概述
[0011] 已证明TNF-α涉及炎症疾病，自身免疫疾病，病毒、细菌和寄生虫感染，恶性肿瘤 和/或神经变性疾病，它是采用特异性生物学方法治疗疾病，如类风湿关节炎和克罗恩病 的有用靶标。TNF-α抑制剂，如抗-TNFa抗体是一类重要的治疗剂。因此，需要检测存在 抗-TNF α生物制剂和/或及自身抗体的试验方法。
[0012] 因此，在一个实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物的存在或水平的 方法，包括：
[0013] (a)使标记TNF α与含有或怀疑含有抗-TNF α药物的样品接触，形成含抗-TNF a 药物的标记复合物（即免疫复合物或偶联物），（其中标记TNF α和抗-TNF α药物彼此不 共价结合）；
[0014] (b)标记复合物进行分子大小排阻层析以（如从游离的标记TNFa中）分离标记 的复合物；和
[0015] (c)检测标记的复合物，从而检测抗-TNF α药物的存在或水平。
[0016] 在某些情况下，所述方法可用于检测例如接受抗-TNFa药物治疗对象的样品中 REMICADE?(英夫利昔单抗）、ENBREL?(依那西普）、HUMIRA?(阿达木单抗）和CIMZIA? (赛妥珠单抗）的水平。
[0017] 在另一实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水 平的方法，包括：
[0018] (a)使标记抗-TNF α药物与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身抗体的样品接触， 形成含自身抗体的标记复合物（即免疫复合物或偶联物），（其中标记抗-TNFa药物与自 身抗体彼此不共价结合）；
[0019] (b)标记复合物进行分子大小排阻层析以（如从游离的标记TNF α药物中）分离 标记的复合物；和
[0020] (C)检测标记的复合物，从而检测自身抗体的存在或水平。
[0021] 在某些情况下，所述方法可用于检测例如接受抗-TNFa药物治疗对象样品中的 自身抗体水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗体（HACA)、人抗-人源化抗体（HAHA)和人 抗-小鼠抗体（HAMA)。
[0022] 在另一实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在或水 平的方法，包括：
[0023] (a)使标记抗-TNF α药物和标记TNF α与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身 抗体的样品接触，在标记抗-TNFa药物、标记TNFa与自身抗体之间形成第一标记复合 物（即免疫复合物或偶联物）；（其中第一标记复合物的组分彼此不共价结合）和在标记 抗-TNFa药物与自身抗体之间形成第二标记复合物（即免疫复合物或偶联物），（其中第 二标记复合物的组分彼此不共价结合），其中标记抗-TNF α药物和标记TNF α所含的标记 不相同；
[0024] (b)第一标记复合物和第二标记复合物进行分子大小排阻层析，以分离第一标记 复合物与第二标记复合物（例如彼此分离，和与游离的标记TNF α和游离的标记抗-TNF a 药物分离）；和
[0025] (C)检测第一标记复合物和第二标记复合物，从而当第一标记复合物和第二标记 复合物都存在时，检测非中和形式自身抗体（即不干扰抗-TNFa药物与TNFa之间结合的 自身抗体）的存在或水平；当只存在第二标记复合物时，检测中和形式自身抗体（即干扰 抗-TNF α药物与TNF α之间结合的自身抗体）的存在或水平。
[0026] 在某些情况下，所述方法可用于检测接受抗-TNF α药物治疗对象样品中的自身 抗体水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗体（HACA)、人抗-人源化抗体（HAHA)和人抗-小 鼠抗体（HAMA)。
[0027] 在一个相关实施方式中，本发明提供检测样品中抗-TNFa药物自身抗体的存在 或水平的方法，包括：
[0028] (a)使标记抗-TNF α药物与含有或怀疑含有抗-TNF α药物自身抗体的样品接触， 在标记抗-TNF α药物与自身抗体之间形成第一标记复合物（即免疫复合物或偶联物）（其 中标记抗-TNF α药物与自身抗体彼此不共价结合）；
[0029] (b)第一标记复合物进行分子大小排阻层析，以（如从游离的标记抗-TNFa药物 中）分离第一标记复合物；
[0030] (C)检测第一标记复合物，从而检测存在的自身抗体或其水平；
[0031] (d)使标记TNF α与第一标记复合物接触，在标记TNF α药物与标记TNF α之间形 成第二标记复合物（即免疫复合物或偶联物）（其中标记抗-TNF α药物与标记TNF α彼此 不共价结合），其中标记TNF α药物与标记TNF α所含的标记不相同；
[0032] (e)第二标记复合物进行第二分子大小排阻层析，以（如从游离的标记TNF α中） 分离第二标记复合物；和
[0033] (f)检测第二标记复合物，从而检测中和形式的自身抗体（即干扰抗-TNF α药物 与TNF- α之间结合的自身抗体）的存在或水平。
[0034] 在某些情况下，所述方法可用于检测接受抗-TNF α药物治疗对象样品中的自身 抗体的水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗体（HACA)、人抗-人源化抗体（HAHA)和人抗-小 鼠抗体（HAMA)。
[0035] 在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供确定 抗-TNF α药物有效量的方法，所述方法包括：
[0036] (a)测量对象第一样品中的抗-TNF α药物水平，包括：
[0037] (i)使第一样品接触一定量的标记TNF a，形成含标记TNF α与抗-TNF α药物的 第一复合物；和
[0038] (ii)用分子大小排阻层析检测第一复合物，从而测量抗-TNF α药物的水平；
[0039] (b)测量所述对象第二样品中抗-TNFa药物自身抗体的水平，包括：
[0040] ⑴使第二样品接触一定量的标记抗-TNF α药物，形成含标记抗-TNF α药物与自 身抗体的第二复合物；和
[0041] (ii)用分子大小排阻层析检测第二复合物，从而检测自身抗体的水平；和
[0042] (c)从步骤（a)测得的抗-TNFa药物水平减去步骤（b)测得的自身抗体水平，从 而测得抗-TNFa药物的有效量。
[0043] 在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化 抗-TNF α药物治疗剂量的方法，所述方法包括：
[0044] (a)按照本发明方法测定抗-TNF α药物的有效量；
[0045] (b)比较抗-TNF α药物的有效量与抗-TNF α药物的水平；和
[0046] (c)根据步骤（b)的比较，确定抗-TNF α药物的后续剂量，从而最优化抗-TNF a 药物的治疗剂量。
[0047] 在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化 抗-TNF α药物治疗和/或减轻其毒性的方法，所述方法包括：：
[0048] (a)测定所述对象第一样品中的抗-TNF α药物水平；
[0049] (b)测定所述对象第二样品中抗-TNF α药物自身抗体的水平；和
[0050] (c)根据抗-TNF α药物和自身抗体水平，确定所述对象的后续疗程，从而最优化 抗-TNF α药物的治疗和/或减轻其毒性。
[0051] 在另一个实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有抗-TNFa 药物的样品中抗-TNF α药物的存在或水平的方法，所述方法包括：
[0052] (a)使一定量的标记TNF α和一定量的标记内部对照接触样品，形成标记TNF α与 抗-TNF α药物的复合物；
[0053] (b)用分子大小排阻层析检测标记TNF α和标记内部对照；
[0054] (c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记TNF α峰 曲线下面积的积分；
[0055] (d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图像计算标记内部对照 峰曲线下面积的积分；
[0056] (e)用标记TNFa的量除以标记内部对照的量确定第一比率；
[0057] (f)用步骤（C)测得的积分除以步骤（d)测得的积分确定第二比率；和
[0058] (g)比较步骤（e)测得的第一比率与步骤（f)测得的第二比率，从而参比内部对照 确定抗-TNF α药物的存在或水平
[0059] 在另一个实施方式中，本发明向接受抗-TNFa药物治疗的对象提供最优化 抗-TNF α药物治疗剂量的方法，所述方法包括：根据上面章节步骤（e)的标记TNF α与标 记内部对照比率和上面章节步骤（f)的标记TNFa与标记内部对照比率的比较，确定所述 对象抗-TNF α药物的后续剂量，从而最优化抗-TNF α药物的治疗剂量。
[0060] 在某些实施方式中，本发明提供参比内部对照检测含有或怀疑含有自身抗体的样 品中抗-TNF α药物自身抗体的存在或水平的方法，所述方法包括：
[0061] (a)使一定量的标记抗-TNFa药物和一定量的标记内部对照与样品接触，形成标 记抗-TNF a药物与自身抗体的复合物；
[0062] (b)用分子大小排阻层析检测标记抗-TNF a和标记内部对照；
[0063] (c)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图计算标记抗-TNFa 药物峰曲线下面积的积分；
[0064] (d)从作为分子大小排阻层析洗脱时间的函数的信号强度图计算标记内部对照峰 曲线下面积的积分；
[0065] (e)将标记抗-TNFa药物含量除以标记内部对照含量，测得第一比率；和
[0066] (f)除以步骤（C)和⑷所得的积分，测得第二比率；和
[0067] (g)比较步骤（e)测得的第一比率与步骤（f)测得的第二比率，从而参比内部对照 确定自身抗体的存在或水平。
[0068] 在另一个实施方式中，本发明提供测定样品中抗-TNFa药物的存在或水平，和 抗-TNF a药物自身抗体的存在或水平的试剂盒，该试剂盒包括：
[0069] (a)含一定量的标记TNF α的第一检测底物；
[0070] (b)含一定量的标记抗-TNFa的第二检测底物；
[0071] (c)任选的第三检测底物，其含一定量的标记TNFa和一定量的标记内部对照；
[0072] (d)任选的第四检测底物，其含一定量的标记抗-TNF a药物a和一定量的标记内 部对照；
[0073] (e)任选的提取对象样品的工具；和
[0074] (f)任选的使用该试剂盒的说明书小册。
[0075] 本领域技术人员通过阅读以下详述和【附图说明】将会明白本发明的其他目的、特征 和优点。
[0076] 附图简要说明
[0077] 图1.显示本发明试验的示例实施方式，其中采用分子大小排阻HPLC来检测 TNF a -Alexa647与