采用寿命编码的复合悬液分析/阵列的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明整体涉及复合分析和/或阵列；在一个实例中，更具体地涉及基于悬液的分析和/或阵列。换言之，本发明提供一种用于生物技术和生命科学实例领域的方法、系统和/或设备，如生物分子物种的确定和量化及防伪如防伪油墨或印刷。
【背景技术】
[0002]分子生物学前沿需要能够同时确定和量化大量生物分子物种的高通量分析技术。这涵盖基因组学、蛋白质组学、细胞间和分子信号、代谢组学、细胞组学和个体化用药广泛的生物信息学领域。例如，因为每个人的遗传特征变化很大，且传统的症状诊断技术经常无法诊断，新兴个体化用药领域致力于检测个体基因表达谱，以将重点放在针对个体特定的治疗上。现在，受分析速度和成本及基因组/蛋白质组的复杂性阻碍，目前无法更广泛的采用这种个体化生物分子诊断。理想工具将是能够支持不是几十个而是数千个不同分子靶标的分析通道文库或数据库。
[0003]在数据存储中，复合的主要目标是提高空间有限的存储元件中数据存储能力。在钞票、身份证、商标标签等的防伪印刷中，复合有助于防止伪造、篡改或仿造，为了该目的，已经使用热变色、磁性、多色荧光剂和光变可变色油墨。复合一般需要地理想由纳米/微米尺寸物体承载的光学编码的矩阵，每种物体应当可高速准确确定，并优选低成本的。
[0004]原则上，用于复合分析技术的平面阵列生物芯片提供基于平面阵列中微点预定位置的无限复合能力。然而，实际上，此技术未提供足够准确的量化数据。例如，因为其要求高度精确的机器人编码、扩散问题和/或每个反应微点之间变化的生物环境。另外，相对较高的制造成本和要求在分析前制造确定格式的阵列板妨碍或抑制有益定制。
[0005]悬液阵列是新兴技术，将是未来基于复合分析的分子检测的领导技术。悬液阵列基于特别编码(最常用的是改变荧光染料组合)的全部微球。因此，微球被赋予一系列分别分配给特定分析物的个体可确定颜色编码。悬液阵列的主要优势包括快速反应动力学、无需洗涤带来更高的样品通量及微球系列的再现制造。由于微载体的均匀表面、使用简单及与替代产品相比费用降低，悬液阵列还为量化分析提供了可能性。
[0006]目前使用悬液阵列可得到的光谱复合水平限制为约100，通过在不同强度比下用荧光染料编码微球实现。通过使用颜色和强度产生更大量的编码比较困难，因为在最受欢迎的微球材料聚苯乙烯中荧光染料和本底荧光的宽光谱宽度。替代方法包括使用不同尺寸和形状的微球、图案化反射金属纳米棒、微加工特征、空间选择光学漂白微球、稀土质谱流式细胞术和稀土掺杂玻璃微条形码。这些方法被认为不可能成为主流，因为存在各种缺陷(例如尺寸大和/或高密度材料)。
[0007]图形编码，例如将颗粒设计为ID条形码、2D甚至是3D型式，提供可与平面阵列媲美的复合能力。但是，图形代码的解密需要主动定向机制和高分辨率的型式确定，基本限制分析通量。电子编码还可以形成大量代码，但是主要缺点来自对大尺寸的要求(>100 μπι)。包括利用拉曼散射、IR吸收或质谱指纹的图谱编码以及利用尺寸、形状和磁的物理编码的其他技术的应用也因其各自的局限而受到限制。
[0008]基于不同荧光色带的数字化强度的光学编码被视为是最可行的方法。然而，尽管尝试使用新型材料如量子点取代传统有机染料，但是当需要多于约十种强度时，荧光探针的光谱重叠是有问题的。光学编码的复合能力实际上仍局限为约102。给如此庞大数量的编码解码呈现出另一个难题。尽管在原则上基于成像的解码系统能够给任何悬液阵列解码，但是平面上一些颗粒高度的细微变化都将严重妨碍基于强度的解码过程。
[0009]因此，还有些悬而未决的问题需要克服或改进，以提供新或改善的复合分析和/或阵列，例如能够增加编码维数，其中表面量化结合分析对这些编码免疫。这些编码应该能够在高通量条件下被解开。
[0010]本说明书中提及的任何现有出版物(或来自现有出版物的信息)或任何已知事物均不得视为或应该被视为承认、许可或任何形式的表明现有出版物(或从现有出版物得到的信息)或已知事物构成本发明相关领域公识常识的一部分。
【发明内容】
[0011]提供该总结是为了简单介绍在下面优选实施方式中详细说明的概念选择。该总结并不旨在确定权利要求主题事物的关键特征或重要特征，也不是为了限制权利要求主题事物的范围。
[0012]在各种形式中，本发明提供一种系统、设备和/或用于复合分析的方法。具体但不限于实例，提供了一种复合阵列如悬液阵列。
[0013]作为具有一般临床潜能的平面阵列的替代品，悬液阵列遭受内部容量实际限制为约12个编码的问题。申请人已经开发了一种新型复合阵列，在一个优选实例中，提供了一种利用和/或设计探针的荧光衰减寿命编码悬液阵列以及解码由时间分辨光谱产生、得到或形成的编码的方法。在一个实例形式中，可以在不同色带形成寿命种群，例如通过用于不同探针的多重机制。
[0014]采用一种新型基于时域的技术或维度，或用之取代或与传统光谱和强度组合结合，从而扩展复合阵列如悬液阵列的复合能力。在一个实例形式中，传统悬液阵列的复合能力可以扩展至约16数量级。通常，传统光谱编码能够形成用于珠面生物分析的自发荧光背景，影响灵敏度和量化性能。
[0015]申请人已经意识到利用寿命(与荧光直接相关的参数)的潜能，使得除了光谱和强度，可以利用寿命形成光学标识(optical identity)的新维度，用于针对高通量筛选的复合检测。特别地，与已知传统方法相比，荧光探针为寿命维度提供了更大的用武之地和无背景优势，使得寿命的控制和差分提供实际和准确的替代方法。
[0016]在实例形式中，申请人已经开发了基于稀土荧光的光学编码和/或探针，其在可见光照明下为黑暗，以及用于敏化和量化表面分子生物分析的无背景或背景减少的基质如珠基质。这个及其他实例形式为复合分析提供了一种可靠、高通量且相对便宜的方案，带来大量机遇或应用，例如生命科学和生物应用包括基因组学、蛋白质组学、药物学、诊断学等，防伪应用包括防伪油墨、或钞票、身份证、商标标签等的防伪印刷，以及数据存储应用。
[0017]一方面，本发明提供了一种用于确定复合阵列中荧光探针的复合分析方法，该方法包括:激发所述荧光探针以产生荧光；以及测量由激发所产生的荧光的衰减寿命。
[0018]另一方面，提供了一种用于检测分析物的复合分析系统，所述系统包括:配置为结合分析物的荧光探针；用于激发荧光探针以产生荧光的激发器；以及用于测量由激发所产生的荧光的衰减寿命的检测器。
[0019]另一方面，本发明提供了一种用于复合阵列的荧光探针，所述荧光探针包括能够被激发以产生荧光的稀土元素，从而能够测量激发所产生的荧光的衰减寿命。
[0020]优选地，复合阵列为悬液阵列。
[0021]在一个实例中，该方法还包括:激发多个荧光探针以产生荧光；测量荧光的多个衰减寿命；以及时间分辨荧光，以确定荧光探针的类型。
[0022]在另一个实例形式中，时间分辨荧光提供不同类型的荧光探针的寿命种群(lifetime populat1n)。在另一个实例形式中，衰减寿命为微秒衰减寿命。在另一个实例形式中，时间分辨荧光提供一个或多个编码。在另一个实例形式中，在不同色带形成时间分辨荧光。在另一个实例形式中，不同色带用于提供基于时域的光学标识的文库。在另一个实例形式中，激发探针包括将探针暴露于电磁辐射中。
[0023]在另一个实例形式中，通过UV辐射激发荧光探针。在另一个实例形式中，通过IR辐射激发荧光探针。在另一个实例形式中，荧光探针在可见光激发时保持黑暗。在另一个实例形式中，荧光探针为微球的一部分。在另一个实例形式中，探针包括一种或多种稀土元素。在另一个实例形式中，所探针包括一种或多种镧系元素。
[0024]在另一个实例形式中，已经使用荧光共振能量转移(LRET)改变了荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，使用LRET先前调整具有可区分衰减寿命的两种或更多种探针。
[0025]在另一个实例形式中，荧光探针包括一种或多种纳米晶体。在另一个实例形式中，荧光探针的衰减寿命通过改变纳米晶体已经改变。在另一个实例形式中，通过调整纳米晶体的掺杂浓度已经改变了荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，纳米晶体为稀土掺杂的上变频(上转换，upconvers1n)纳米晶体。在另一个实例形式中，通过改变供体与受体距离，改变衰减寿命。在另一个实例形式中，通过改变供体和受体的各自浓度，改变供体与受体距离。在另一个实例形式中，通过调整敏化剂(sensitizer)-激活剂的浓度差，改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，纳米晶体掺杂镱敏化剂和铒或铥发射剂。在另一个实例形式中，纳米晶体被封装到微球中。在另一个实例形式中，通过调整纳米晶体的尺寸，已经改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，通过调整纳米晶体的晶体相，改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，在单个色带中，存在多于十个具有不同衰减寿命的纳米晶体种群。
[0026]在另一个实例形式中，衰减寿命在25.6ys至662.4ys之间。在另一个实例形式中，通过添加淬灭染料已经改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，通过在探针内使用金属基体(matrix)调整衰减寿命已经改变荧光探针的衰减寿命。在另一个实例形式中，焚光探针包括不同镧系元素复合螯合物(complex chelate)或不同基质晶体(hostcrystal)结构。在另一个实例形式中，除了测量荧光光谱和荧光强度，还测量荧光衰减寿命O
[0027]在其他实例形式中，探针选自微球、组装以提供微球的纳米颗粒或纳米晶体、稀土掺杂的二氧化硅微球、嵌入钯(Pd)和/或铂(Pt)磷光的微球、嵌入电荷转移(CT)激发跃迀发射剂的微球及嵌入钌、锇或铼电荷转移(CT)激发跃迀发射剂的微球的组中。
[0028]在另一个实例形式中，提供了至少五个红色带中的不同衰减寿命。在另一个实例形式中，提供了至少五个蓝色带中的不同衰减寿命。在另一个实例形式中，提供了至少四个绿色带中不同衰减寿命。在另一个实例形式中，对于UV脉冲激发束(excitat1n beam)和IR脉冲激发束照射，使用带通滤色器将探针分辨为四个通道(channel)，每个通道具有初始强度参数和衰减寿命参数，从而提供八个维度。
[0029]在其他实例形式中，探针为纳米或微米标签、球、颗粒或载体。在其他实例形式中，探针包括选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钪和钇中的元素。
【附图说明】
[0030]从以下说明中，实例实施方式应该变得显而易见，其仅是通过至少一个优选而非限制性实施方式的实施例并结合附图描述给出。
[0031]图1示出了一种时间分辨悬液阵列的实例解码概念。
[0032]图2通过每个微球的寿命直方图示出了编码微秒域时间分辨悬液阵列的实例方法。具体地，(a)荧光共振能量转移法，(b)将上变频纳米晶体作为构造单元的实例悬液阵列组件，(C)通过调节敏化剂-激活剂的浓度差的上变频能量转移方法，及(d)通过调整上变频纳米晶体的尺寸和相位的尺寸相关的荧光方法。
[0033]图3示出了单个微球的实例绘图，以及携带编码寿命的五个种群的时间分辨分离。
[0034]图4示出三维时间分辨光谱，例如应用UV和IR脉冲激发束后的编码微球(a)，其可以使用带通彩色过滤器分解成四个通道，每个通道有自己的初始强度和衰减寿命作为两个独立参数(b)，导致共计八个维度作为八个数字(C)。
[0035]图5a示出了 Eu螯合物(低于365nm)、Er和Tm上变频纳米晶体(低于980nm)的标准化发射光谱。
[0036]图5b示出了 Er和Tm发射带在不同强度水平时的光谱重叠。
[0037]图5c示出了对实例微球测得的寿命，与并入相同单个探针的微球相比，这种微球并入了混合探针(Eu、Er和Tm)。
[0038]图6示出了 LRET设计的每个含Eu微球的实例寿命测量结果。将含有相同数量Eu复合物的不同溶液作为供体，之后将数量不断增加的受体染料