封装到每组聚合物微球中，然后进行时间分辨扫描细胞计数分析:(a)示出了当原染料溶液中受体浓度上升时，因为较强的LRET效应，在Eu3+红色发射谱带测得的荧光寿命缩短。插图曲线为从单个Eu-LRET微球测得的荧光衰减信号，(b)示出了在实例样品中，五种实例维修给出了完全独立的寿命直方图(如图2a)，从而使它们能够使用时间分辨扫描细胞仪确切区分开。每个直方图左边的数字为高斯拟合平均寿命土寿命CV。
[0039]图7示出了使用寿命编码Eu-LRET实例微球和时间分辨扫描细胞仪进行复合DNA检测的实例示例:(a)选择的五种Eu-LRET微球(参见图6b)与五种不同的DNA序列捕获探针结合(四个与HIV、EV、HBV和HPV-16的病原体DNA互补，另一个用于对照目的)。此夕卜，在夹入珠分析中还使用了通用报告基因染料，(b)通过测量它们Eu3+荧光衰减寿命，将实例微球确定为四种类型，(c)通过测量报告基因染料的荧光强度，确定试样中靶病原体DNA数量。在持续激发下，使用不同发射带通滤波器在500ms暴露时间拍摄图像。(比例尺:10 μ m) ο
[0040]图8示出了寿命调整实例方法和NaYF4: Yb，Tm上变频纳米晶体的时间分辨共聚焦图像。每个像素在激发200 μ s，然后是延迟检测窗口期上达至3.8ms，以记录时间门控荧光衰减。每个像素的阴影或灰度代表从衰减曲线解码得到的其寿命值。所述图像中的纳米晶体从左到右的Tm掺杂浓度分别为4、2、1、0.5和0.2mol%o
[0041]图9示出了通过时间分辨扫描细胞仪系统测得的实例τ点标记的贾地鞭毛虫的结果:(a)和(b)示出了从具有不同寿命编码τ点的鞭毛虫得到的寿命直方图((a)的Tm/Yb掺杂浓度(mol%:mol% )为1:20，(b)为4:20)。扫描细胞仪能够取回荧光的每个靶鞭毛虫及明视场成像确认，(c)示出了相同鞭毛虫在4小时持续激光激发条件下的典型记录荧光图像。
[0042]图10示出了对于作为载有独特寿命代码的复合悬液阵列表示的微球实例τ点编码种群的结果:(a)合成单分散Tm上变频纳米晶体(顶部TEM图像)可以嵌在微球壳上(底部SEM图像)，(b)通过调节敏化剂-激活剂共掺杂浓度，上变频能量转移机理可以在Tm蓝光发射带产生8种微球寿命种群。每个直方图旁边的数字表示从高斯分布拟合得到的平均寿命土寿命CV。轴上的区域代表每个种群占用的寿命资源(±3σ)，而空白处表示可以设计更多种群，(c) 二维(强度与寿命)散点图示出了独立于每个微载体强度的所有寿命污染。
[0043]图11示出了寿命编码文件防伪和光子数据存储应用实例。用不同Tm τ点打印三个重叠图形:“澳大利亚麦考瑞大学”标识为(CTm:CYb)4:20 ;歌剧院图像为1:20，及悉尼港口大桥图像为0.5:20。尽管基于强度的荧光成像仅给出了难以分辨图片(a)的难题，而对比时间分辨扫描根据每个像素的寿命将图形分开(b)，从而使文件相同重叠空间中载有的真正复合信息得以解码(用于描绘c中每个像素的荧光寿命的假彩色/色度)。
【具体实施方式】
[0044]描述通过实施例给出的以下方式旨在提供更精确的理解优选实施方式的主题。
[0045]时间分辨扫描:时域中的复合检测
[0046]申请人已经扩展了复合分析的能力，例如悬液阵列中的复合。这是通过使用或添加新时间维度实现的。在一个实例中，基于寿命，除了光谱复合中目前可能的编码数量外，还已经实现了约100另外编码的可能因子(倍数，factor)，从而将可能复合总水平增加到约10，000或更多编码。这使复合能力与生物样品的实际复杂程度一致，还允许构建或产生承载约10，000编码的探针文库或数据库如特定微球，从而使用户在进行复合分析设计有更大的范围和更大的灵活性。
[0047]复合策略的原理是基于时域作为光谱和强度外的额外维度的探索。在一个实例中，选择一种或多种镧系元素作为实例荧光探针以产生时间分辨悬液阵列。镧系元素具有与它们的超长寿命(>100 μ s)相关的广泛动态范围，以及其他吸引人的性质包括窄发射光谱和大斯托克斯位移。实例实施方式可以单独使用任何一种镧系元素或其任意组合，包括镧、钟、镨、钕、钷、钐、铕、礼、镇、镝、钬、铒、镑、镱和镥。其他实例实施方式可以单独使用任何一种稀土元素或其任意组合，包括除钪和钇之外的十五种镧系元素。
[0048]申请人已经确认了大量精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率及产生单个探针和/或微球的可行技术、方法或机理。在一个非限制性实例中，探针/微球为稀土掺杂的探针/微球。在另一个非限制性实例中，探针/微球为镧系元素掺杂的探针/微球。在另一个非限制性实例中，探针/微球为稀土掺杂的聚苯乙烯探针/微球。
[0049]应当理解地是，各种其他类型的探针/微球也是可能的，包括例如组装以提供微球的纳米颗粒、稀土掺杂的二氧化硅微球、嵌入钯(Pd)和/或铂(Pt)磷光的微球和嵌入电荷转移(CT)激发跃迀发射剂(如钌、锇和铼)的微球。
[0050]具有明确可区分的寿命、通过荧光共振能量转移(LRET)有意调整的两个或更多个靶标的复合检测例如讨论五种实例微球，已经得到证实，并成功用于各种应用，例如不同DNA链的同时探测。
[0051]在多种基于荧光的分析技术中，表现出特别长寿命(毫秒到微秒)的荧光探针与有机荧光团(寿命为纳秒级)相比提供优势，包括无背景生物感应和生物成像(b1imaging)、防伪应用扫描或印刷、高精度能量转移测量和低功率光学超高分辨率成像。这些结果允许在混杂的光谱维度顶部构建带有寿命标识的新光学文库，努力激发需要高级分析方法的生物科学领域或其他领域的新发现，例如防伪油墨或染料。
[0052]荧光例如从有机染料或量子点的衰减寿命一般为几十纳秒的范围内；然而，含有特定族元素的材料，尤其是镧系金属或铂族金属，通常展现出具有从微秒至甚至是毫秒的寿命的延长的荧光衰减。当从荧光寿命测量供体与受体之间的距离时，使用长寿命探针取代有机染料作为共振能量转移供体提供更高的准确度、更大可测量范围以及更高的标记公差。长寿命还可以有助于降低受激发射损耗(STED)超高分辨率成像所需的功率，例如可以在不损坏生物样品或其他物理样品的情况下进行实时监控，如用于安全认证。
[0053]另外，寿命维度在现代防伪应用、微生物学、生物化学和生物医学所需要的高级高通量分析技术中有很大的潜能。在生物应用中，同时筛选多个生物分子物种，称为复合，依赖多个不同生物探针荧光可区分颜色的已知流行技术，然而，其彼此掺混，因为它们的发射光谱通常存在交盖(spillover，溢出)问题。随着生物探针的数量增加，此串扰问题变得更加棘手。例如，如果只需提供全面的颜色补偿，最新多色流式细胞仪就能够测量多达十七种荧光颜色(十一种来自有机染料以及六种来自量子点)，更不用说用于四种激光设备和十七种单独的光检测器及二色镜和带通滤波器不可持续的级联。作为替代方法，已经利用其他分光镜特征如使用特定生物探针的质谱或拉曼光谱，以增加复合容量。然而，这些方法一般与荧光测量不兼容，而荧光测量产生的最终灵敏度往往高出两个数量级。
[0054]与此相反，申请人已经认识到将寿命作为与荧光直接相关的参数的潜能，使得对于针对高通量筛选的复合检测，寿命可以用于产生光学标识的新维度(除了光谱和强度)。特别地，荧光探针为寿命维度提供更大的用武之地和无背景优势，使得与传统已知方法相比，寿命的控制和区分提供实际且准确的替代方法。
[0055]长焚光寿命的辨别一般超出大部分已知的在售系统的能力。寿命参数的提取主要在溶液/悬液中，借助后处理进行，而不是在每个探针或微靶上实时进行。这不仅是因为荧光探针不合适激发/发射波长组合，还因为三大重要原因:1)延长的荧光衰减可能导致基于流行的非线性拟合算法的不可接受的长处理时间；2)对于快速寿命测量的情况(其依赖低水平荧光信号)，不合适的检测通道结构可能实质上无法精确测量超长寿命；3)必须考虑暗电流或暗计数的噪声，在纳秒范围时，对于测量寿命其一般会忽略，因为与长寿命有关的信号分布组合了较高水平的噪声(与检测窗口的长度成比例)，该噪声影响结果的准确性。
[0056]用于调整荧光衰减速率的荧光共振能量转移(LRET)
[0057]精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率的第一种技术、方法或机理基于荧光共振能量转移(LRET)，其中镧系元素络合物例如铕络合物的供体与能量受体如六氟磷酸盐非常接近并彼此相互作用，因此，原本短寿命的受体染料减少长寿命荧光。通过改变供体与受体的各自浓度来改变它们之间的距离，从而能够精细调整供体和受体的荧光寿命，并伴随强度变化。
[0058]参见图2a，其中示出了一种实例荧光共振能量转移方法或工艺。通过添加数量逐渐增加的淬灭染料，可以调整稀土或镧系元素络合物寿命例如铕络合物寿命，形成更多微球种群，例如2、3、4、5或多于5个微球种群。
[0059]为了将荧光团引入微球，采用了借助有机溶剂的溶剂膨胀法(solventswelling)，其允许染料分子渗入微球。当这些微球之后转移到水溶液后，微球收缩，并且供体和受体染料被均匀截留。通过原型时间分辨扫描细胞计数器扫描单个微球，其中将每个微球的615nm(供体铕发射)荧光寿命绘制成直方图，如图2a所示。
[0060]增加受体浓度导致提高的LRET效率且加速铕供体的衰减速率，这与使用建立的公式LRET—致。这允许编码和解码寿命种群。
[0061]寿命CV在1.9 %至5.7 %范围内。形成更多寿命种群的替代方法是通过采用不同稀土络合物，例如不同的铕络合物如新铕络合物BHHBCB、1，2-双[4，_(1"，1〃，1〃，2〃，2〃，3〃，3〃-七氟-4"，6〃-己二酮 _6〃_ 基)苄基]_4_ 氯苯磺酸(sulfobenzene)，其具有520 μ s的更长的焚光寿命。
[0062]用于调整荧光衰减速率的上变频纳米晶体(UPNC)
[0063]精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率的第二种技术、方法或机理基于稀土掺杂的上变频纳米晶体(UPNC)。在本实例中，探针或纳米晶体一般与数千个镱(Yb3+)敏化剂和铒(Er3+)或铥(Tm3+)发射剂共掺杂，这显著增大了可调尺寸在几纳米到几十纳米的每个晶体的整体强度。从敏化剂(Yb3+)到激活剂(Er3+)或(Tm3+)的内部多光子次序能量转移可用于形成单个寿命可调纳米晶体作为构造单元组装到寿命和发射编码探针或微球(也称为超级珠或巨大珠)中。
[0064]通过在NaYF4纳米晶体中以不同浓度和比例共掺杂Yb和Tm，并使用简单的膨胀法将纳米晶体封装到微球中首次证实了此机理。
[0065]参见图2b_d，其中示出了(b)可以通过作为构造单元的上变频纳米晶体组装的悬液阵列；(c)通过调整敏化剂-激活剂浓度差的上变频能量转移方法，可以形成多于5种蓝色带Tm微球种群；(d)通过调整上变频纳米晶体的尺寸和相位实现尺寸相关荧光的方法，可以形成绿光带另外4种Er微球种群。每个种群直方图左边的数字为从高斯统计拟合得到的平均寿命土寿命CV。
[0066]尽管多光子能量转移给敏化剂-激活剂距离和荧光衰减速率之间带来了非线性关系，有趣的是，0.5% -4%的Tm变化(Yb固定在20% )导致在?474nm的从58.3 μ s到369.6 μ s的显著大范围的寿命，而Yb的浓度从10%升高到30% (Tm固定为1% )还显著加速蓝色发射衰减从206.7 μ s变为115.4 μ s?这些结果是使用时间分辨上变频扫描细胞计数器得到的。
[0067]这清楚实现了蓝色带另外五个完全分离的寿命通道。所展示的寿命CV动态范围低至从5%到8%。通过Yb或Tm变化的窄CV和持续可调寿命范围可以轻松支持多达七个寿命通道。
[0068]用于调整荧光衰减速率的上变频纳米晶体(UPNC)的尺寸和相位
[0069]精确或准确调整微秒和/或毫秒荧光衰减速率的第三种技术、方法或机理是基于不同尺寸和相位的上变频纳米晶体的寿命可调特征，如NaYF4:Yb、Er。当Yb和Er掺杂浓度分别固定在20%和2%时，立方相(cubic