异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物的制作方法
【专利说明】异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物
[0001] 相关申请的引用
[0002] 根据35U.S.C. § 119(e)，本申请案要求2012年10月24日提交的美国临时专利 申请序列号61/717, 983的提交日期的优先权；将该申请案的披露通过引用结合于此。
[0003] 引言
[0004] 对于多种应用（包括组织学、细胞学、和免疫学应用）中的生物检测而言，荧光探 针是有用的工具。确切地，在通过流式细胞术、荧光活化细胞分选法和荧光显微镜检术在细 胞混合物中鉴定和分离细胞的亚群方面；在荧光免疫分析中确定结合部分（例如抗原-抗 体结合）的浓度方面；在通过染色在凝胶或其他支持物中定位物质方面，荧光探针发现了 功用。荧光化合物可以被共价地或非共价地附接至其他材料以赋予荧光。明亮的荧光染料 允许以大的敏感性检测或定位附接的材料。
[0005] 当采用用于以上目的的荧光染料时，对于荧光染料的选择存在很多注意事项。一 个注意事项是荧光染料的吸收和发射特征，因为在测试下的样品（例如血液、尿、脑脊液） 中的很多配体、受体、和材料将发出荧光并且干扰荧光标签的荧光的准确测定。这一现象称 为自发荧光或背景荧光。另一注意事项是荧光染料共轭至配体和受体以及其他生物的和非 生物的材料的能力，以及此类共轭对分子特性的潜在作用，例如荧光染料的荧光量子效率 方面的变化。还可能的是，与荧光染料共轭将灭活标记的分子的功能。第三个注意事项是 针对敏感的检测，荧光染料的量子效率应该是高的。第四个注意事项是荧光染料的光吸收 能力、或消光系数还应该尽可能地大。还感兴趣的是，当极为贴近时，无论荧光分子是否将 彼此相互作用，这将导致自淬灭。第五个注意事项是标记染料的光稳定性，这是由于为了最 佳检测，染料共轭物通常经受反复照射。一个另外注意事项是无论通过自身或共轭与荧光 染料共轭的化合物，是否存在荧光染料与其他化合物或容器壁的非特异性结合。
[0006] 因此，具有一个或多个特性（例如高量子效率、良好的光稳定性、在更长波长的吸 收和发射、更高共轭产率、低非特异性干扰、低淬灭和低自聚集）的荧光染料和共轭物是感 兴趣的。
[0007] 概述
[0008] 提供了异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料、其生物共轭物和使用它的方法。 主题染料包括具有氮杂吲哚啉环的花菁染料结构，其中吡啶鎗部分被并入吲哚啉环结构以 形成氮杂吲哚啉环，并且异羟肟酸部分作为一个取代基被附接至氮杂吲哚啉环。在一些情 况下，异羟肟酸部分在氮杂吲哚啉环的位置5被并入。该染料进一步包括在多个位置中的 一个或多个处的反应基部分（RGM)。
[0009] 本发明的方面包括反应性异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它们的共轭 物，其中主题染料被共轭至感兴趣的底物。在一些情况下，底物包括特异性结合至感兴趣的 分析物的结合部分。在某些情况下，染料共轭物是串联共轭物，其中染料被共轭至荧光蛋 白。该染料会能够进行使用共轭的荧光蛋白的FRET。染料荧光蛋白共轭物可以被进一步共 轭至特异性结合感兴趣的分析物的结合部分。
[0010] 提供了检测样品中的分析物的方法。该方法的方面包括使样品与检测试剂接触。 在一些情况下，检测剂是染料共轭物，该染料共轭物包括特异性地结合分析物的特异性结 合部分。在一些情况下，检测剂是共轭至分析物的反应性染料。该方法的方面进一步包括 用荧光检测分析物。在定位或检测样品中的分析物或配体的相互作用或存在方面，染料化 合物和染料共轭物找到了用途。还提供的是组合物，例如试剂盒等，将这样的染料或染料共 轭物并入有助于它们在此类方法中的应用。
[0011] 附图简要说明
[0012] 图1示出了在PBS缓冲液（pH= 7.4)中，化合物26(右）和Cy5(左）的吸收光 谱。与Cy5相比，化合物26的最大吸收波长红移了约63nm。
[0013] 图2示出了在PBS缓冲液（pH= 7.4,在630nm激发）中，化合物26(右）和 Cy5(左）的荧光光谱。与Cy5相比，化合物26的最大荧光波长红移了约66nm。
[0014] 图3说明了在PBS缓冲液（pH= 7. 4)中，化合物12、48和55与AlexaFluor? 700NHS酯的光稳定性比较（实例43)。
[0015] 图4说明了在PBS缓冲液（pH=7. 4)中，APC化合物12、48、50、53和54串联物 与APC-AlexaFluor?700串联物的光稳定性比较（实例43)。
[0016] 图5示出了包括附接至异羟肟酸的接头反应基部分（L-RGM)的异羟肟酸取代的氮 杂吲哚啉-花菁染料的合成方案。
[0017] 图6示出了包括L-RGM取代的吲哚啉环的异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁的合 成。
[0018] 图7示出了包括分别位于异羟肟酸和吲哚啉部分的两个L-RGM基团的异羟肟酸取 代的氮杂吲哚啉-花菁的合成。
[0019] 图8示出了与CD8-AlexaFluor.?700共轭物相比，使用CD8抗体分别与化合物12 和48的染料-抗体共轭物所获得的免疫染色数据。
[0020] 图9示出了与APC-H7相比，使用⑶20抗体与化合物12的染料-抗体共轭物所获 得的免疫染色数据。
[0021] 图10示出了与APC-Cy5. 5和APC-AlexaF!u〇r?700相比，使用标记有APC化合 物12的CD8抗体的串联染料-抗体共轭物所获得的免疫染色数据。
[0022] 图11示出了与⑶19抗体标记的AlexaFluor?相比，使用标记有APC化合物12 串联物的CD19抗体的染料-抗体共轭物所获得的免疫染色数据。
[0023] 图12示出了化合物12 (R700)串联物和直接的CD8共轭物对比APC和APC-H7共 轭物的亮度比较。与R700直接共轭物和传统染料共轭物二者相比，APC-R700串联共轭物 要更加明亮。
[0024] 图13示出与Alexa700染料相比，化合物12 (R700)的串联共轭物具有更少％溢 出进入APC和APC-Cy7、以及PerCP-Cy5. 5共轭物。
[0025] 定义
[0026] 以下术语具有以下意义，除非另外指明。任何未定义的术语都具有它们的本领域 公认的意义。
[0027] "烷基"是指具有从1至10个碳原子并且例如是1至6个碳原子、或1至5、或1 至4、或1至3个碳原子的一价饱和脂肪族烃基。通过举例，这一术语包括直链的和支链的 烃基，例如甲基（CH3-)、乙基（CH3CH2-)、正丙基（CH3CH2CH2-)、异丙基（(CH3) 2CH-)、正丁基 (CH3CH2CH2CH2-)S((CH3)2CHCH2-)S((CH3) (CH3CH2)CH-)S((CH3) 3C-)>iE 戊基（CH3CH2CH2CH2CH2-)、和新戊基（(CH3)3CCH2-)。
[0028] 术语"取代的烷基"是指如在此定义的烷基，其中烷基链中的一个或多个碳原子已 经任选地被以下取代：杂原子（例如-〇-、-N-、-S-)，-S(0)n-(其中n是0至2)，-NR-(其 中R是氢或烷基），并且具有从1至5个选自下组的取代基，该组由以下各项组成：烷氧基、 取代的烷氧基，环烷基，取代的环烷基，环烯基，取代的环烯基，酰基，酰氨基，酰氧基，氨基， 氨酰基，氨基酰氧基，氧氨基酰基，叠氮基，氰基，卤素，羟基，氧代，硫酮（thioketo)，羧基， 竣烷基，硫代芳氧基，硫代杂芳氧基，硫代杂环氧基，硫醇，硫代烷氧基，取代的硫代烷氧基， 芳基，芳氧基，杂芳基，杂芳基氧基，杂环基，杂环氧基，羟氨基，烷氧基氨基，硝基，-so-烷 基，-so-芳基，-so-杂芳基，-SO2-烷基，-SO2-芳基，-SO2-杂芳基，以及-NRaRb,其中R'和 R"可以是相同的或不同的并且选自氢，任选取代的烷基，环烷基，烯基，环烯基，炔基，芳基， 杂芳基和杂环。
[0029] "亚烷基"是指二价脂肪族烃基，该烃基具有直链的或支链的优选从1至6个 并且更优选1至3个碳原子，并且该烃基任选地被选自以下项的一个或多个基团中 断：-0-、-NR1(I-、-NRltlC(0)-、-C(O)NRltl-等。通过举例，这一术语包括亚甲基（-CH2-)、亚 乙基（-CH2CH2-)、正亚丙基（-CH2CH2CH2-)、异亚丙基（-CH2CH(CH3)-)、（(-C(CH3) 2CH2CH2-)、 (-C(CH3) 2CH2C(0)-)、（-C(CH3) 2CH2C(0)NH-)、（-CH(CH3)CH2-)、等。
[0030] "取代的亚烷基"是指如在以下"取代的"定义中对碳所做描述，具有I至3个氢被 取代基取代的亚烷基。
[0031] 如在此定义，术语"烷烃"是指烷基和亚烷基。
[0032] 术语"烷基氨基烷基"、"烷基氨基烯基"和"烷基氨基炔基"是指基团R'NHR"一 其中R'是如在此定义的烷基并且R"是如在此定义的亚烷基、亚烯基或亚炔基。
[0033] 术语"烷芳基"或"芳烷基"是指基团-亚烷基-芳基和-取代的亚烷基-芳基， 其中在此定义了亚烷基、取代的亚烷基和芳基。
[0034] "烷氧基"是指基团-0-烷基，其中烷基如在此定义。通过举例，烷氧基包括甲氧 基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、等。术语"烧氧 基"还指基团烯基 _〇_、环烷基_〇_、环烯基_〇 _、和炔基_〇_，其中烯基、环烷基、环烯基、和块 基如在此定义。
[0035] 术语"取代的烷氧基"是指基团取代的烷基-0-、取代的烯基-0-、取代的环烷 基-〇-、取代的环烯基-〇-、和取代的炔基-〇-，其中取代的烷基，取代的烯基，取代的环烷 基，取代的环烯基和取代的炔基如在此定义。
[0036] 如在此定义，术语"烷氧基氨基"是指基团-NH-烷氧基，其中在此定义了烷氧基。
[0037] 术语"卤代烷氧基"是指基团烷基-0_，其中烷基上的一个或多个氢原子已经被卤 素基团取代，并且通过举例，包括基团，例如三氟甲氧基等。
[0038] 术语"卤烷基"是指如以上所述的取代的烷基，其中烷基上的一个或多个氢原子已 经被卤素基团取代。此类基团的实例包括但不局限于氟烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、三 氣乙基等。
[0039] 术语"烷基烷氧基"是指基团-亚烷基_〇_烷基、亚烷基 _〇_取代的烷基、取代的 亚烷基-o-烷基、和取代的亚烷基-o-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亚烷基和取代的 亚烷基如在此定义。
[0040] 术语"烷基硫代烷氧基"是指基团_亚烷基_S_烷基、亚烷基-S-取代的烷基、取 代的亚烷基-S-烷基、和取代的亚烷基-S-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亚烷基和取 代的亚烷基如在此定义。
[0041] "烯基"是指直链的或支链的烃基，该烃基具有从2至6个碳原子并且优选是2至 4个碳原子，并且具有至少1个并且优选是从1至2个位点的双键不饱和度。通过举例，这 一术语包括二_乙烯基、烯丙基、以及丁 -3-烯-1-基。包括在这一术语内的是顺反异构体 或这些异构体的混合物。
[0042] 术语"取代的烯基"是指具有选自以下项的从1至5个取代基、或从1至3个取代 基的如在此定义的烯基：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环 烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基酰基、叠氮基、 氛基、卤素、羟基、氧代、硫丽（thioketo)、竣基、竣烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂 环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、 杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳 基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
[0043] "炔基"是指直链的或支链的一价烃基，该烃基具有从2至6个碳原子并且优选是 2至3个碳原子，并且具有至少1个并且优选是从1至2个位点的三键不饱和度。此类炔基 的实例包括乙炔基（-C=CH)、和炔丙基（-CH2C=CH)。
[0044] 术语"取代的炔基"是指具有选自以下项的从1至5个取代基、或从1至3个取代 基的如在此定义的炔基：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环 烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基酰基、叠氮基、 氛基、卤素、羟基、氧代、硫丽（thioketo)、竣基、竣烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂 环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、杂环基、 杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-so-芳基、-so-杂芳 基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、SO2-芳基和-SO2-杂芳基。
[0045] "炔氧基"是指基团-0-炔基，其中炔基如在此定义。通过举例，炔氧基包括乙炔 氧基、丙块氧基、等。
[0046] "醜基"是指基团H-C(O) _、烷基-C(O) _、取代的烷基-C(O) _、烯基-C(O) _、取代 的烯基_C(0) _、炔基-C(O) _、取代的炔基-C(O) _、环烷基-C(O) _、