除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人 员所一般理解的具有相同含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的任何方法和材料也 可以用于本发明的实践或测试中，现在将对优选方法和材料进行描述。
[0137] 在本说明书中引用的所有公开物和专利通过引用结合于此，就像每个单独公开物 或专利被确切地并且单独地指示为通过引用被结合并且通过引用结合于此，以结合所引用 的这些公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对在提交日 之前的披露，并且不能理解为承认因为先前发明而本发明不能获得比这些公开物更早的申 请日。另外，提供的公开物的日期可以不同于实际公开日期，实际公开日期可能需要被独立 核实。
[0138] 应指出，如在此使用的，并且在所附权利要求书中，单数形式"一个"、"一种"、以及 "该"包括复数指代物，除非上下文另外清晰地指示。另外指出的是，权利要求书可以撰写以 排除任何可选择的要素。这样的陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术 语诸如"单独"、"仅"等或利用"否定型"限定的前提基础。
[0139] 应理解，出于清楚的目的描述于分开的实施例的情形中的本发明某些特征还可以 按组合形式提供于单个实施例中。相反，为简便起见，在单一实施例的背景下描述的本发明 的不同特征也可以单独地或者以任何适合的子组合提供，而不偏离本发明的范围或精神。 可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
[0140] 详细说明
[0141] 本披露提供了异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料、染料共轭物、和制造与使 用它们的方法。在以下部分中更详细地描述了各自的实施例。
[0142] 在一些情况下，将异羟肟酸和氮杂吲哚啉环系统并入花菁染料生成染料-底物共 轭物（例如蛋白、核酸和其他生物聚合物共轭物），如与标记有常规染料的共轭物相比，该 共轭物实质性地荧光更多、并且具有多个改进的荧光特性中的任一个。主题染料的共轭物 可以提供减少的不希望的效果，例如淬灭、缺乏光稳定性、低量子效率、或染料的荧光特性 中的不希望的变化。本发明的染料-生物分子共轭物的增强的荧光强度导致当共轭至生物 聚合物后，它们的吸收光谱中的更大的测定敏感性和减少的假象。此外，主题染料还可以具 有显著增强的光稳定性。异羟肟酸取代基的添加增加了主题染料的光稳定性。这些改进导 致使用主题染料和它们的共轭物的测定中显著更大的敏感性，同时利用了用于与类似染料 (例如Cy5、Cy5. 5、AlexaFluor700和Cy7) -起使用的已经可商购的现有滤光器和仪器 装备。
[0143] 另外，在一些情况下，主题染料显示出长于常见碳菁染料的吸收最大值，所以可以 选择这些染料来匹配氦氖激光器（633nm)或更长波长激光二极管的主要发射谱线。这对于 在红外波长下透明的样品而言是有用的。在一些实例中，本发明的染料具有在氦氖激光器 的30nm的发射谱线内（例如20nm内、IOnm内、或5nm内）的吸收最大值。
[0144] 在一些实例中，这些染料具有550nm或更大，例如580nm或更大、590nm或更大、 600nm或更大、610nm或更大、620nm或更大、630nm或更大、640nm或更大、650nm或更大、 660nm或更大、680nm或更大、690nm或更大、700nm或更大、710nm或更大、720nm或更大、 730nm或更大、740nm或更大、750nm或更大、或甚至更大的吸收最大值。
[0145] 在一些实例中，这些染料具有600nm或更大，例如620nm或更大、640nm或更大、 650nm或更大、660nm或更大、680nm或更大、700nm或更大、720nm或更大、740nm或更大、 750nm或更大、760nm或更大、780nm或更大、800nm或更大、或甚至更大的发射最大值。
[0146] 主题染料和它们的共轭物可以具有用于生物检测的多个有用特性。在一些实施例 中，染料化合物和/或共轭物具有高的光稳定性（例如是光稳定的）。在一些实施例中，染 料化合物和/或共轭物在更长波长具有希望的吸收和发射特征，这减少了来自测试下的样 品（例如血液、尿、脑脊液）中的许多配体、受体、和材料的自发荧光或背景荧光的干扰。在 一些实施例中，染料化合物以高产率被容易地共轭至生物分子（例如抗体），在染料的荧光 特性和配体的结合特性方面具有很小变化或没有变化。在一些实施例中，这些染料具有高 量子效率。在一些实施例中，这些染料具有大消光系数。
[0147] 异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物
[0148] 异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料是花菁基染料，该染料包括经由聚甲炔连 接基团连接的第一环系统和第二环系统。第一环系统可以是在任何方便位置被异羟肟酸基 团取代的氮杂吲哚啉环系统。第二环系统可以是任何方便的环系统。在一些实施例中，第 二环系统包括5元杂环。染料可以进一步包括一个或多个反应性基团部分，用于将染料共 轭至底物。染料可以包括在任何方便位置的一个或多个水溶性基团。
[0149] 氮杂吲哚啉环系统可以在任何方便位置被连接至聚甲炔连接基团。在一些情况 下，氮杂吲哚啉环系统在位置2被连接至聚甲炔连接基团。在一些情况下，氮杂吲哚啉环系 统包括被并入吲哚啉环结构的吡啶鎗部分，以形成氮杂吲哚啉环。如在此使用，术语"氮杂 吲哚啉环系统"、"氮杂吲哚啉"和"氮杂吲哚啉衍生物"可互换地使用，并且独自地或作为另 一基团的一部分，是指包含以下稠合的环结构之一的任何部分或它的衍生物：
[0150]
【主权项】
1. 一种5-异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料化合物，包括经由二价聚甲炔连接基 团连接至5-元杂环的5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉基团，其中所述5-异羟肟酸-氮杂吲哚啉 基团、所述二价聚甲炔连接基团和所述5-元杂环中的一个或多个被反应性基团部分（RGM) 取代。
2. 根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是由式I所描述：
其中： 环B表示对于形成含氮五元杂环所必需的原子并且进一步包括零至三个稠合的芳香 族环；其中所述五元杂环和所述零至三个稠合的芳香族环的每个原子独立地选自下组，该 组由以下各项组成：C、CH、C(烷基）、C(芳基）、0、S、N、N(芳基）和N(烷基），并且所述五 元杂环和所述零至三个芳香族环任选地被选自下组的一个或多个取代基取代，该组由以下 各项组成：氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟甲基、卤素、甲硫 基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、和L-RGM; n是0至3 ; 札-馬各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、 杂芳基、氣基、烧氣基、芳氣基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙-醇、烷氧基、 芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; &和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基 烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM; &和R7各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳烷基、 杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM; 馬和R9各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧基、三氟 甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM; R1(l和各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷 基、磺烷基、或L-RGM; RGM是化学反应性基团；并且 L是接头。
3. 根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是由式II所描述： 其甲：
n是0至3 ; 札-馬各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、 杂芳基、氣基、烧氣基、芳氣基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙-醇、烷氧基、 芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; &和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、芳烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM； R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳 烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、磺烷基、或L-RGM; R8、馬和R17 -R2Q各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧 基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM; R1(l和各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷 基、磺烷基、或L-RGM; RGM是化学反应性基团； L是接头；并且 任选地，R4和R5、R6和R7、1?5和R9、札5和R16、R4和R2。、R4和R6/R7、或 &/1?7和R15/%6中 的一个或多个按组合而取，以形成5-至50-元环。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是由式III所描述： 其中
n是0至3 ; 札-馬各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、 杂芳基、氣基、烧氣基、芳氣基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙-醇、烷氧基、 芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; &和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基 烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳 烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; R8、馬和R17 -馬2各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧 基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM;MPRn是氢、烷 基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、或L-RGM; RGM是化学反应性基团； L是接头；并且 任选地，R4和R5、R6和R7、1?5和R9、札5和R16、R4和R22、R4和R6/R7、或 &/1?7和R15/%6中 的一个或多个按组合而取，以形成5-至50-元环。
5. 根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是由式IV所描述：
其中： n是0至3 ; 札-馬各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、 杂芳基、氣基、烧氣基、芳氣基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙-醇、烷氧基、 芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; &和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基 烷基、羧烷基、磺烷基、膦酰基烷基、或L-RGM; R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳 烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM; R8、馬和R17 -馬2各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧 基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM;MPRn是氢、烷 基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM; RGM是化学反应性基团； L是接头；并且 任选地，R4和R5、R6和R7、1?5和R9、札5和R16、R4和R18、R4和R6/R7、或 &/1?7和R15/%6中 的一个或多个按组合而取，以形成5-至50-元环。
6. 根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是由式V所描述： 其中.
n是0至3 ; 札-馬各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、 杂芳基、氣基、烧氣基、芳氣基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙-醇、烷氧基、 芳氧基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; &和R5各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳烷基、杂芳基 烷基、羧烷基、膦酰基烷基、磺酰基烷基、或L-RGM; R6、R7、R15和R16各自独立地是具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、芳 烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、羧基芳基、膦酰基烷基、磺烷基、或L-RGM; R8、馬和R17 -馬2各自独立地是氢、具有1-20个碳的烷基、羟基、具有1-20个碳的烷氧 基、三氟甲基、卤素、甲硫基、羰基、氨基、硫醇、磺酸盐、膦酰基、或L-RGM; R1(l和Rii各自独立地是氢、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳基烷基、羧烷基、磺烷基、膦 酰基烷基、或L-RGM; RGM是化学反应性基团； L是接头；并且 任选地，&和R7、馬和R9、MPR16、&和R18、&和R6/R7、或R6/R4PR15/R16中的一个或 多个按组合而取，以形成5 -至50 -元环。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是由式VI所描述：
其中： n是0至3 ; 札-馬各自独立地是氢、卤素、具有1-20个碳的烷基、具有3-20个碳的环烷基、芳基、 杂芳基、氣基、烧氣基、芳氣基、硫醇、烷基硫醇、芳基硫醇、杂芳基硫醇、聚乙-醇、烷氧基、 芳氧基、羧烷基、或