用于生物芯片上生物分子靶的libs定量测量的方法和设备的制造方法_3

文档序号:8417403阅读:来源:国知局
以用通常的方式正常地将探针-靶生物分子结合物放置在这种生物芯片的表面上。
[0057]本发明的主题也是用于生物芯片的预杂交或杂交的设备或“试剂盒”,例如至少一种包括佐剂的溶液,其用于生物芯片的预杂交、杂交或漂洗,所述佐剂允许在生物芯片的表面上形成干燥基质。
[0058]因此,本发明的主题也是生物芯片,所述生物芯片的支持物因此包括在其表面的一层干燥基质203。
[0059]不管所考虑的实施方案,有利地在靶生物分子上形成的干燥基质203的厚度平均不应大于I毫米。对于更大的厚度,由激光形成的等离子体可能实际上不包含可能用于分析的合理比例内的痕量靶生物分子。
[0060]在每个描述的实施方案中,每个探针211可以有利地包含形成内部标准的标准化元素,其使得有可能标准化通过LIBS获得的信号。根据本发明的一个特征性,如先前已经描述的,标准化元素可以由直接地复合至每个探针211的元素来形成,例如通过接枝技术。如果探针211由抗体形成,所述抗体可以因此直接地通过接枝用标准化元素来标记。标准化元素可以例如通过元素(例如硼)来构成。
[0061]下面参照图4A和4B描述了相对于靶分子和/或探针的标准化元素配置的实施例,其分别对应于先前3A和3C所描述的配置。
[0062]参照图4A,标准化元素405可以直接地固定至位于支持物200上的探针211,例如通过接枝技术。根据对应于参照先前所描述的图3A的第一配置,由探针211和靶201形成的组件可以由干燥基质203包住。
[0063]参照图4B,标准化元素405可以直接固定至位于支持物200上的探针211,例如经由接枝技术。根据对应于参照先前所描述的图3C第三配置,形成干燥基质203的佐剂分子可以例如以该实施例直接地复合至探针211。
[0064]佐剂的光谱谱线具有的波长与用于定量分析所使用的光谱谱线的波长不同,其包括用于标准化的光谱谱线和用于定量靶和/或其翻译后修饰的光谱谱线。
[0065]以下详细描述了由申请人进行的根据本发明实施方案之一的方法的两个提议的条件。申请人特别地通过进行磷酸化蛋白质的分析制定了分析方法的条件,更具体的在Α2β-酪蛋白重构的体外模型上进行了分析,其中通过电感耦合发射光谱的分析方法定性已知浓度的酪蛋白的溶液,通常将该溶液称为电感耦合等离子体-原子发射光谱(对应于缩写ICP-AES);并且在含有外源磷的生物分子模型上进行了分析,其中分子靶Η2ΑΧ磷酸化的程度可以随意诱导。根据本发明的非限制性的实施例,下文中详细介绍了与该分析相关的方法和设备,该分析方法和设备可以应用于其他靶生物分子,特别是任何磷酸化的蛋白。应该观察到下面描述的实施例没有以任何方式限制本发明,并且实施例对应于特定情况,其中在每个方法步骤过程中加入佐剂,并且根据参照先前所描述的图2Α的实施方案在生物芯片支持物上形成干燥基质使得包住靶生物分子。然而,参照前面所描述的图2Β至2D的各种可替代的方式也可以无区别的应用和导致相似的结果。也可能仅在单个方法步骤中引入佐剂。
[0066]在生物芯片上沉积靶的实施例(无探针蛋白质芯片)。
[0067]Α2β-酪蛋白的分子量等于23.983千道尔顿。这种蛋白可以例如以冻干形式供给,然后,例如,通过通常缩写为HPLC (对应于高效液相色谱法)的普通方法来纯化,例如使用包含水(H2O)、三氟乙酸(TFA)和甲腈(或乙腈)的溶液。蛋白质的浓度可以例如通过紫外分光光度计的方法来确定。
[0068]为了评估通过LIBS光谱分析的效率,β -酪蛋白磷酸化的分析可以通过已知的且好评可靠的替代方法进行从而提供参考测量。为此,可以利用ICP-AES类的分析方法,该方法是用来确定液体化合物的主要组成的参考方法。本申请人用0、4、12和20 μΜ(微摩尔)浓度的β -酪蛋白溶液进行ICP-AES分析。
[0069]为了确定用于蛋白质磷酸化定量的LIBS光谱的灵敏度,不同量的β-酪蛋白直接地沉积在由卡普顿-环氧树脂制成的支持物上,卡普顿-环氧树脂薄膜(例如使用氰基丙烯酸酯粘合剂)粘合至显微镜玻片(例如以7.5X2.5厘米玻片的形式)上。
[0070]由此得到的酪蛋白溶液在pH为7.5,0.1M tris缓冲溶液中系列稀释到0、40、85、170、257和350 μ M的浓度,该制剂称为“制剂A”,在包含pH为7.5,0.1M tris和ImM蔗糖的缓冲溶液中稀释的制剂,称为“制剂B”,以及在包含pH为7.5,0.1M tris, ImM蔗糖和0.5mM硼的缓冲溶液中稀释的制剂,称为“制剂C”。这些制剂的单独地5次重复地沉积在卡普顿-环氧树脂薄膜上,并在室温下干燥30分钟。
[0071]抗体生物芯片的实施例
[0072]可以通过梯度细胞分离从肝素化的人类血液样品分离淋巴细胞。细胞用磷酸盐缓冲盐水或PBS洗涤两次,在培养基(例如含10%胎牛血清或FCS,I %的青霉素-链霉素的介质)中稀释至16个细胞/毫升的浓度,并且立即用钴60辐照器以2Gray -min ―1的剂量水平,以0、0.5、2和4Gray辐射。辐射后,细胞迅速在培养基中以5 X 15细胞/ml的浓度来稀释,并且在γΗ2ΑΧ磷酸化水平的定量之前,于温度37°C在含有5%浓度的二氧化碳的气氛中培养一小时。
[0073]为了获得适用于通过LIBS分析的磷酸化定量的基质,有必要使抗体基质本身无磷。抗-γΗ2ΑΧ.139抗体可以选择用于此目的。然后将渗析的抗体沉积在由卡普顿或卡普顿-环氧树脂形成的支持物上,例如包含25微米的卡普顿层的支持物,或包含用25微米的环氧树脂层覆盖的25微米的卡普顿层的支持物。
[0074]将抗体放置于卡普顿-环氧树脂薄膜层之上。100微升体积的抗-γ Η2ΑΧ.139在pH为7.5的包含0.1M tris和ImM蔗糖的缓冲溶液中,于温度4°C渗析四小时。
[0075]渗析后,抗-γ H2AXsel:139溶液的浓度在0.1M tris缓冲溶液中的ImM的硼中调节至0.5mg/ml,并且将I微升体积的溶液放置于卡普顿_环氧树脂薄膜上基质的每个孔中,然后在室温下干燥30分钟。为了避免蛋白质与卡普顿-环氧树脂薄膜层的非特异性结合,介质的游离环氧官能基在包含tris、lmM蔗糖和5%浓度的葡萄聚糖的溶液中用IX超封闭缓冲溶液或SBB溶液在室温下饱和30分钟,轻轻搅拌。支持物可以用包含ImM的蔗糖和0.1%的聚山梨醇酯20的trsi缓冲溶液或IX TBS型的溶液中洗涤三次,该溶液也用来洗涤根据本发明方法中的抗体基质。抗体在支持物上持久的固定可以通过荧光扫描仪进行分析,磷的不存在可由LIBS来确认。
[0076]为了允许靶抗原的提取,通过以10000转/分的速度离心两分钟沉淀淋巴细胞,放置在微波炉中(450瓦特的功率)15秒,然后以I毫克/毫升的蛋白质浓度悬浮于包含0.1Mtris和ImM蔗糖的缓冲溶液中。
[0077]对于蛋白质-抗体结合,蛋白质在包含ImM蔗糖的IX SBB缓冲溶液中稀释至0.1毫克/毫升的浓度,并且于温度4°C培养12小时。由此产生的抗体基质在包含ImM的蔗糖和0.1 %的聚山梨醇酯20的tris (IX TBS)缓冲盐溶液中洗涤,并在包含ImM蔗糖的tris (IXTBS)缓冲盐溶液中洗涤15分钟伴随搅拌,两次,然后在室温下干燥。
[0078]关于通过参考方法的分析,以每个剂量辐射的淋巴细胞等分试样通过流式细胞仪或FACS进行分析。细胞在4°C的温度下不加热洗涤,而后在70°标准强度的酒精中固定和透化,持续I小时。然后细胞在室温下用抗-γ H2AXSOTl39抗体溶液在包含2% FCS的PBS中培养一小时。在洗涤和离心之后获得沉淀,将沉淀重悬并用抗-小鼠二级抗体孵育一小时,所述抗-小鼠二级抗体用异硫氰酸荧光素类型的荧光团或FITC标记。然后洗涤细胞,离心并再悬浮于包含碘化丙啶和核糖核酸酶的PBS中。使用流式细胞仪分析至少14个细胞并且每个细胞的荧光强度通过合
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