鸦葱总黄酮的制备方法及其指纹图谱的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸦葱总黄酮的制备方法；一种鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法， 以及由该方法所得的鸦葱总黄酮标准指纹图谱，属于中药分析领域。
【背景技术】
[0002] 鸦葱为菊科植物Scorzonera austriaca Wild的干燥全草。五月~六月米挖、 晒干。本品全长10~40厘米；根粗壮，倒圆锥状，直径约0. 3~3厘米；茎多数，簇生于 根颈顶端，不分枝，光滑无毛，茎基被稠密褐色的纤维状撕裂的鞘状残遗；基生叶广披针形 至长圆状卵形，长20~30 (-40)厘米，宽1. 2~3. 5 (-5)厘米，边缘平展，基部鞘状扩大， 鞘内被稠密的棉毛，基部边缘有棉毛；茎生叶少数，1~3枚，鳞片状；头状花序单生茎顶， 瘦果无毛。鸦葱作为传统中药，全草入药，具有清热解毒、消炎、通乳的功效，主治痈疮、 淋病、妇女带下、乳腺炎等症。鸦葱也是一味传统藏药（藏名：巴多拉）。关于鸦葱化学 成分的研宄除本研宄室外，只有武全香、祝英、李娟等报道了鸦葱中倍半萜类和三萜类化 学成分的研宄（Wu Q X，Su Y B, Zhu Y. Triterpenes and steroids from the roots of Scorzonera austriaca[J]. Fitoterapia. 2011, 82(3):493 - 496) > (Zhu Y, Hu P Z, He Z ff,et al. Sesquiterpene Lactones from Scorzonera austriaca[J]. Journal of Natural Products. 2010, 73(2):237 - 241)> (Zhu Y, Wu Q X, Hu P Z, et al. Biguaiascorzolides A and B:Two novel dimeric guaianolides with a rare skeleton from Scorzonera austriaca[J]. Food Chemistry. 2009, 114(4):1316 - 1320) > (Li J, Wu Q X, Shi Y P, et al. A new sesquiterpene lactone from Scorzonera austriaca[J]. Chinese Chemical Letters. 2004, 15 (11) : 1309 - 1310)，Ting-Fu Jiang 等报道了香豆素类化学成分的研 宄(T.F. Jiang et.al. Determination of kavalactones and flavonoid glycoside in Scorzonera austriaca by capillary zone electrophoresis[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007, 43 (3) :854-858)。本研宄室对鸦葱中 黄酮类化学成分进行了研宄（李泉妙，王广树.鸦葱中黄酮苷类成分的提取分离与结构 鉴定[J].吉林大学学报（医学版），2010, 36(1): 10-12)、（刘欣，张子龙，王广树等.鸦葱 中黄酮成分的提取分离及结构鉴定[J].吉林大学学报（医学版），2012, 38 (3) :595-597)、 (何碌.鸦葱中黄酮类化合物的研宄[D].吉林大学研宄生学位论文，2012)、（李泉妙.鸦 葱中化学成分的研宄及保肝活性的初探[D].吉林大学研宄生学位论文，2008)。迄今为 止，本研宄室从鸦葱中分得了 10余种黄酮类化合物，对总黄酮提取物进行了生物活性研 宄，发现鸦葱总黄酮具有治疗肝炎和保肝作用，于2013年获得了中国发明专利（一种鸦葱 总提取物及其在制备治疗肝炎或保肝药物中的用途，专利号ZL 201110255235. 1，授权公告 日2013-06-04)。本研宄室正在进行以鸦葱为原料，以鸦葱总黄酮为有效部位，以治疗病毒 性肝炎为目标的新药创制的研宄，并获得了国家科技重大专项的资助（国家科技重大专项 "重大新药创制"，治疗病毒性肝炎创新药物-YCZT的研宄，2013ZX09103002-007)。中药指纹 图谱技术是目前国内外公认的用来控制中药、天然药物或中药材整体质量最有效、最准确、 最直接的手段，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别方法，其基本属性是"整体性"和"模 糊性"。"整体性"是指完整地比较色谱的特征"面貌"；"模糊性"强调的是对照物与待测样 品指纹图谱的相似性。运用指纹图谱技术可以鉴别中药材和中成药的真伪，评价原料药材、 半成品和成品质量的均一性和稳定性。
[0003] 综上所述，为了开发以鸦葱总黄酮为有效部位，以治疗病毒性肝炎为目标的新药， 有必要研宄鸦葱总黄酮的制备方法及其质量控制方法。为此本研宄室发明了一种鸦葱总黄 酮的制备方法，以此方法制备的鸦葱总黄酮中黄酮类成分含量提高至90%以上，同时发明 一种鸦葱总黄酮的指纹图谱建立方法及标准指纹图谱，该方法操作简便、稳定和重现性好， 能全面、准确地控制鸦葱总黄酮的质量。
【发明内容】
[0004] 发明的目的是为了开发以鸦葱总黄酮为有效部位，以治疗病毒性肝炎为目标的新 药，提供一种稳定可行的鸦葱总黄酮的制备方法和一种由该方法制得的鸦葱总黄酮质量控 制方法，其特点是（1)由该方法制备的鸦葱总黄酮中黄酮类成分含量提高至90%以上；（2) 将鸦葱总黄酮制备成供试品溶液后，经过高效液相色谱仪分离检测，获得鸦葱总黄酮的指 纹图谱，该方法操作简便，稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地控制鸦葱总黄酮 的质量。
[0005] 1.本发明鸦葱总黄酮的制备方法具体包括如下步骤：
[0006] 1)鸦葱全草用70%乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液过滤后浓缩除醇，过滤，经 DlOl型大孔树脂柱吸附，水、60%乙醇洗脱，收集60 %乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，干燥， 得鸦葱提取物；
[0007] 2)将鸦葱提取物用水溶解，上样于D4020型大孔树脂柱色谱，先以5%乙醇除杂， 再收集10%~30%乙醇洗脱的黄酮类成分组分，合并后减压回收溶剂，干燥至恒重，即得 鸦葱总黄酮。
[0008] 2.本发明一种鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法具体包括如下步骤：
[0009] 1)供试品溶液的制备：取鸦葱总黄酮，60%乙醇超声溶解并定容，作为供试品溶 液；
[0010] 2)参照物溶液的制备：取鸦葱黄酮苷A对照品，60%乙醇超声溶解并定容，作为参 照物溶液；
[0011] 3)制作鸦葱总黄酮指纹图谱：分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液，经高效液 相色谱仪分离检测，其中，流动相的组成为乙腈-0.1%甲酸水溶液；采用梯度洗脱；得到鸦 葱总黄酮指纹图谱。
[0012] 其中，供试品溶液按如下步骤制备：精密称定各批次经干燥至恒重的鸦葱总黄酮 0. 0020g，60%乙醇超声溶解并定容于IOml容量瓶中，摇匀后，作为供试品溶液。
[0013] 对照物溶液按如下步骤制备：精密称定鸦葱黄酮苷A 0. 0020g，60 %乙醇超声溶 解并定容于IOml容量瓶中，摇匀后备用。
[0014] 色谱条件为：Phenomenex Gemini 5 μ m C18110A，250mmX 4. 6mm，5 μ m 色谱柱；流 动相A为色谱乙腈，B为0. 1 %甲酸-水；流速0. 8mL · min-1;柱温30°C ;检测波长337nm ; 进样量 10 yL。梯度洗脱程序：0· 01 ~L 00min，97%~86% B ;7· 01 ~30. 00min，86%~ 83% B ;30· Ol ~60. 00min，83%~65% B ;60· Ol ~65. 00min，65%~0% B。
[0015] 本发明还提供由上述鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法得到的鸦葱总黄酮标准指 纹图谱。
[0016] 将12份鸦葱总黄酮样品按上述方法制备成供试品溶液，在高效液相色谱仪上分 离检测，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得 到鸦葱总黄酮标准指纹图谱。
[0017] 所述标准指纹图谱有14个特征峰，第5号色谱峰对应鸦葱黄酮苷A，图谱总长度为 65min，5号峰平均保留时间为32. 17min，以5号峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间和 相对峰面积，平均相对保留时间和相对峰面积如下：
[0018] 1号峰，平均相对保留时间为0. 7942,平均相对峰面积为0. 3068 ;
[0019] 2号峰，平均相对保留时间为0. 8936,平均相对峰面积为0. 3782 ;
[0020] 3号峰，平均相对保留时间为0. 9338,平均相对峰面积为1. 4074 ;
[0021] 4号峰，平均相对保留时间为0. 9565,平均相对峰面积为0. 4556 ;
[0022] 5号峰，平均相对保留时间为1. 0000,平均相对峰面积为1. 0000 ;
[0023] 6号峰，平均相对保留时间为1. 0516,平均相对峰面积为0. 5007 ;
[0024] 7号峰，平均相对保留时间为1. 1694,平均相对峰面积为0. 0639 ;
[0025] 8号峰，平均相对保留时间为1. 2372,平均相对峰面积为0. 3296 ;
[0026] 9号峰，平均相对保留时间为1. 2631，平均相对峰面积为0. 0802 ;
[0027] 10号峰，平均相对保留时间为1. 5411，平均相对峰面积为0. 0527 ;
[0028] 11号峰，平均相对保留时间为1. 5724,平均相对峰面积为0. 5788 ;
[0029] 12号峰，平均相对保留时间为1. 5893,平均相对峰面积为0. 0602 ;
[0030] 13号峰，平均相对保留时间为1. 6623,平均相对峰面积为0. 2276 ;
[0031] 14号峰，平均相对保留时间为1. 7810,平均相对峰面积为0. 0527。
[0032] 本发明鸦葱总黄酮的制备方法和鸦葱总黄酮的指纹图谱建立方法及标准指纹图 谱有如下显著的优点：
[0033] (1)本发明鸦葱总黄酮的制备方法中所采用的大孔吸附树脂具有机械强度高、吸 附性能好、选择性高、价格低廉、预处理及再回收方法简单等，纯化方法稳定可行，纯化后黄 酮类成分含量提高至90%以上。
[0034] (2)色谱条件容易实现，乙腈系统柱压较低，有利于系统的稳定。
[0035] (3)本发明色谱条件下的各特征色谱峰均实现了基线分离，不仅能从整体上对鸦 葱总黄酮进行模糊识别，也可对比参照物色谱对鸦葱总黄酮进行清晰鉴别及鸦葱总黄酮的 多组分定量分析；
[0036] (4)本发明方法稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地控制鸦葱总黄酮的 质量。
【附图说明】
[0037] 附图1 5种大孔吸附树脂静态吸附动力学曲线；
[0038] 附图2不同浓度乙醇对黄酮的解吸情况；
[0039] 附图3是鸦葱总黄酮特征指纹图谱，图中从左到右分别是第1至14号特征峰；
[0040] 附图4是鸦葱总黄酮的参照物鸦葱黄酮苷A图谱。
【具体实施方式】
[0041] 实施例1 :鸦葱总黄酮的制备方法
[0042] 1)药品、试剂和仪器
[0043] SHIMADZU LC