-10AT VP Plus高相液相色谱仪（日本岛津），AR1530分析天平（美 国奥豪斯），BT12?型准微量电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），KQ-250B型 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），SHZ-95B型循环水式多用真空泵（巩义市予华 仪器有限责任公司），SDC-6节能型智能恒温槽（宁波新芝生物科技股份有限公司），R502B 型旋转蒸发器（上海豫康科教仪器设备有限公司），RE-52AA型旋转蒸发器（上海雅荣生化 仪器设备有限公司），ZF-7型暗箱三用紫外线分析仪（上海嘉鹏科技有限公司），HZQ-2型 恒温振荡器（金坛市华城开元实验仪器厂），UV-2100型紫外分光光度计（美国尤尼克）， UVmini-1240型紫外分光光度仪（日本岛津）。
[0044] D101、D4020、NKA-9、X-5、AB-8型大孔吸附树脂（天津南开和成科技有限公司）， GF254薄层层析硅胶、聚酰胺薄膜、柱层析硅胶200~300目（青岛海洋化工厂），ODS高纯 填料GH0DSA12S50(日本），色谱纯化学试剂（Fisher Scientific)及分析纯化学试剂（北 京化工厂），水为超纯水。
[0045] 鸦葱药材共12批采自于吉林省四平地区，经吉林大学药学院生药教研室张静敏 教授鉴定为鸦葱 Scorzonera austriaca Wild。
[0046] 2)对照品鸦葱黄酮苷A的制备
[0047] 鸦葱全草用70%乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液过滤后浓缩除醇，过滤， 经DlOl型大孔树脂柱吸附，水、60 %乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇， 干燥，得鸦葱提取物。通过硅胶柱色谱、ODS柱色谱等分离纯化手段，得到鸦葱黄酮苷A : 5, 7, 3 ^V -四羟基黄酮-6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷（1.刘欣，张子龙，王广树等.鸦葱 中黄酮成分的提取分离及结构鉴定[J].吉林大学学报（医学版），2012, 38 (3) :595-597); 2.何碌.鸦葱中黄酮类化合物的研宄[D].吉林大学研宄生学位论文，2012)。经纯度分 析（色谱条件：色谱柱：Phenomenex Gemini 5u C18110A(250mmX4.6mm，5ym);流动相： 乙腈（A)-O. 1%甲酸水溶液（B);流速：0. 8mL · mirT1;柱温：30°C ;检测波长：337nm ;梯度 洗脱程序：〇· 01 ~7. OOmin, 97 % ~86 % B ;7· 01 ~30.0 Omin, 86 % ~83 % B ;30· 01 ~ 60.0 Omin, 83%~65% B ;60· 01 ~65. OOmin, 65%~0% B)可作为对照品。HPLC 色谱图见 附图4,保留时间32. 17min，理论塔板数39168. 496,峰面积99. 085%，拖尾因子1.080。
[0048] 3)鸦葱中黄酮类化合物的定量分析方法
[0049] a.对照品溶液的制备和供试品溶液的制备
[0050] 精密称定干燥至恒重的鸦葱黄酮苷A，用60%乙醇制成0. 104mg ^mL-I质量浓度的 对照品溶液。精密称定干燥至恒重的2)项下的鸦葱提取物，用60%乙醇制成0. 400mg ^mL-I 质量浓度的供试品溶液。
[0051] b.标准曲线的绘制
[0052] 分别精确移取鸦葱黄酮苷A对照品溶液0· 1、0· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5、3· 0、4· OmL至 IOmL容量瓶，各加入3mL的1 %三氯化铝-甲醇显色剂和3mL pH = 5的醋酸-醋酸钠缓 冲液，60 %乙醇定容，显色Ih后于390nm波长测定各浓度对照品溶液吸光度A值，以空白 试剂为参照。线性回归得鸦葱黄酮苷A质量浓度X(mg · ml/1)与吸光度A的回归方程A = 19. 676X+0. 004 (R2 = 0· 9999)，X 在 0· 001 ~0· 0416mg · ml/1 范围内线性关系良好。
[0053] c.方法学验证
[0054] 分别精确移取对照品溶液I. 5mL、供试品溶液0. 8mL各六份于IOmL容量瓶中，显色 后测定吸光度A，空白溶液为参照。结果表明，吸光度的RSD分别为0. 68%和1. 44%，说明 精密度良好。
[0055] 分别精确移取对照品溶液2. OmU供试品溶液1.0 mL于IOmL容量瓶，显色后0、10、 20、 30、40、50、60、80、100、12011^11测定吸光度4，空白溶液为参照。结果表明显色601^11之 后测得的吸光度值较稳定，则选取显色Ih之后进行吸光度测定。
[0056] 取同一干燥至恒重的鸦葱提取物5份，制成供试品溶液，各精密移取1.0 mL，显色 Ih后测定吸光度，由标准曲线计算黄酮含量。结果表明吸光度和黄酮含量的RSD分别为 0. 83%和0. 28%，说明该方法重复性良好。
[0057] 精密移取1.0 mL已测定质量浓度为0. 404mg ^mL-I的供试品溶液6份于6只IOmL 容量瓶中，分别加入〇. l〇4mg · ml/1的对照品溶液0、0. 5、0. 8、1. 2、1. 5、1. 8mL，按上述方法 测定吸光度，计算黄酮含量和回收率。结果显示，5次试验的加标回收率结果均在100%~ 105%之间，平均加标回收率103. 6%，RSD为1.08%，说明该方法有可行性。
[0058] 4)大孔树脂纯化鸦葱总黄酮的研宄
[0059] a大孔树脂预处理
[0060] 将AB-8、D101、D4020、NKA-9和X-5型等5种型号的大孔吸附树脂均完全浸泡于 95%乙醇中待充分溶胀，24h后装于层析柱内，用95%乙醇淋洗树脂直至洗脱液加入适量 水后不再混浊，再用水洗至无醇味。将树脂完全浸泡于5% HCl中4h并淋洗2倍体积，用蒸 馏水洗至中性。将树脂完全浸泡于5% NaOH中4h并淋洗2倍体积，用蒸馏水洗至中性。
[0061] b静态吸附试验和静态解吸试验
[0062] 将适量预处理好的5种型号大孔吸附树脂干燥，分别称取干燥的AB-8、D101、 D4020、NKA-9 和 X-5 型大孔树脂 2· 241、1· 640、2· 165、2· 513、2· 067g，均相当于体积 10mL，置于250mL具塞三角瓶中，各加入按3) a项下方法配制的鸦葱提取物样品溶液 (0. 520mg ^mL-I) 20mL，与大孔树脂混匀后置于恒温振荡器中，水浴振荡24h使充分吸附，再 从上清液精密移取0. 5mL于IOmL容量瓶中，显色后测定吸光度，计算黄酮质量浓度变化、吸 附量和吸附率（见表1)。
[0063] 分别将吸附了鸦葱提取物的5种大孔树脂过滤处理后，置于250mL具塞三角瓶中， 各加入95%乙醇20mL，密封后均置于恒温振荡器中解吸。解吸24h后从上清液精密移取 0. 5mL于IOmL容量瓶中，显色后测定吸光度，计算黄酮质量浓度变化、解吸量和解吸率（见 表1)。
[0064] 表1 5种大孔吸附树脂的静态吸附及解吸性能
[0065]
【主权项】
1. 鸦葱总黄酮的制备方法，其特征在于采用溶剂浸泡法进行提取，利用特定的大孔树 脂柱色谱制备鸦葱总黄酮； 所述方法包括如下步骤： 1) 鸦葱全草用70%乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液过滤后浓缩除醇，过滤，经DlOl 型大孔树脂柱吸附，水、60 %乙醇洗脱，收集60 %乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，干燥，得鸦 葱提取物； 2) 将鸦葱提取物用水溶解，上样于D4020型大孔树脂柱色谱，先以5 %乙醇除杂，再收 集10%~30%乙醇洗脱的黄酮类成分组分，合并后减压回收溶剂，干燥至恒重，即得鸦葱 总黄酮。
2. 鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法，其特征在于将鸦葱总黄酮制成供试品溶液，经高 效液相色谱仪分离检测，获得鸦葱的指纹图谱； 所述方法包括如下步骤： 1) 供试品溶液的制备：取鸦葱总黄酮，60%乙醇超声溶解并定容，作为供试品溶液； 2) 参照物溶液的制备：取鸦葱黄酮苷A对照品，60%乙醇超声溶解并定容，作为参照物 溶液； 3) 制作鸦葱总黄酮指纹图谱：分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液，经高效液相色 谱仪分离检测，其中，流动相的组成为乙腈-0. 1 %甲酸水溶液；采用梯度洗脱；得到鸦葱总 黄酮指纹图谱。
3. 如权利要求2所述的鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法，其特征在于所述的高效液 相色谱仪分离检测条件为：色谱柱为，Phenomenex Gemini 5 ym C18 110A，250mmX4. 6mm， 5 y m色谱柱；流动相A为色谱乙腈，B为0.1 %甲酸-水；流速0. 8mL ? miiT1;柱温30°C ; 检测波长337nm;进样量10yL，梯度洗脱程序：0. 01~7. 00min，97%~86% B;7. 01~ 30.00min，86%~83%B;30.01~60.00min，83%~65%B;60.01~65.00min，65%~0% B0
4. 由权利2至3中所述的鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法得到的鸦葱总黄酮标准指纹 图谱，其特征在于：图谱总长度为65min，有14个特征峰，第5号色谱峰对应鸦葱黄酮苷A， 5号峰平均保留时间为32. 17min，以5号峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰 面积，平均相对保留时间和相对峰面积如下： 1号峰，平均相对保留时间为0. 7942,平均相对峰面积为0. 3068 ; 2号峰，平均相对保留时间为0. 8936,平均相对峰面积为0. 3782 ; 3号峰，平均相对保留时间为0. 9338,平均相对峰面积为1. 4074 ; 4号峰，平均相对保留时间为0. 9565,平均相对峰面积为0. 4556 ; 5号峰，平均相对保留时间为1. 0000,平均相对峰面积为1. 0000 ; 6号峰，平均相对保留时间为1. 0516,平均相对峰面积为0. 5007 ; 7号峰，平均相对保留时间为1. 1694,平均相对峰面积为0. 0639 ; 8号峰，平均相对保留时间为1. 2372,平均相对峰面积为0. 3296 ; 9号峰，平均相对保留时间为1. 2631，平均相对峰面积为0. 0802 ; 10号峰，平均相对保留时间为1. 5411，平均相对峰面积为0. 0527 ; 11号峰，平均相对保留时间为1. 5724,平均相对峰面积为0. 5788 ; 12号峰，平均相对保留时间为I. 5893,平均相对峰面积为0. 0602 ; 13号峰，平均相对保留时间为1. 6623,平均相对峰面积为0. 2276 ; 14号峰，平均相对保留时间为1. 7810,平均相对峰面积为0. 0527。
【专利摘要】本发明提供了一种鸦葱总黄酮的制备方法及其指纹图谱，具体步骤为采用溶剂浸泡法进行提取，利用大孔树脂柱色谱制备鸦葱总黄酮；将鸦葱总黄酮制备成供试品溶液，在一定的条件下经过高效液相色谱仪的分离检测，获得鸦葱总黄酮的指纹图谱。本发明提供的鸦葱总黄酮的制备方法，操作简便，稳定可行，由该方法制备的鸦葱总黄酮中黄酮类成分含量提高至90％以上；本发明提供的鸦葱总黄酮的指纹图谱，操作简便，稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地评价鸦葱总黄酮的质量。
【IPC分类】G01N30-06, G01N30-88
【公开号】CN104807944
【申请号】CN201510250247
【发明人】王广树, 谢扬
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月15日