一种检测重金属铬的免疫分析方法及免疫分析检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测铬（包括三价铬、六价铬和总 铬）的免疫分析方法及检测铬的免疫分析检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 铬是一种银白色的金属，表面具光泽，质地坚硬而脆，具有良好的延展性。自然界 没有游离状态的铬，主要的矿物是铬铁矿。常见的化合价有三价和六价，三价铬具有热力 学稳定性，是人体必需的一个微量元素，具有生物学功能，例如，铬作为葡萄糖耐受因子的 活性组分，给营养不良、糖尿病和健康人，补充适量的铬均能有效提高人体对葡萄糖的耐受 性，能有效增强胰岛素的活性；铬缺乏能够增加患心血管疾病的风险。但过量的铬会对人体 健康带来伤害，有体外实验证明，细胞中高浓度的三价铬能导致DNA损伤，对人体的皮肤也 具有刺激性。
[0003] 而六价铬通常以铬酸盐（CrO，）和重铬酸盐（Cr20广）形式存在，具有变应原性、 遗传毒性和致癌性。由于六价铬分子量小，能很容易的经过硫酸盐通道进入细胞内部，从 而在细胞内大量蓄积，能够造成DNA损伤，如链断裂和形成各种各样的Cr-DNA加合物。六 价铬导致癌症发生的机制是：低浓度六价铬存在下，形成严重的DNA损伤，并经错配修复 (mismatchrepair，MMR)途径，导致染色体畸形；而高剂量六价络条件下，微卫星不稳定性 的产生导致功能性的错配修复(mismatchrepair,MMR)完全丧失，使得基因突变频率增加， 最终导致癌症发生。六价铬在生物系统内依赖抗坏血酸盐经过一系列的还原反应最终生成 稳定的三价铬。因此，对重金属铬的检测已列为食品安全检测中的常规检测项目。
[0004] 在食品安全检测和环境监测中，重金属铬的检测大部分采用仪器法（如原子吸收 光谱法、电感耦合等离子体质谱分析法等）和化学显色法（二苯碳酰二肼法）。但仪器法检 测结果精确，但是普遍存在仪器昂贵、对检测样品要求高、需专业技术人员操作和在大量样 品检测时耗费时间长等问题，难以实现现场快速检测的需要。而化学显色法灵敏度又不够 高、较易受样品中其他物质的干扰、在大量样品检测时，所需的耗材较多且耗时较长等。因 此，寻找一种简便、快速和高通量的检测方法就显得十分重要。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明实施例提供了一种检测铬（包括三价铬、六价铬和总铬） 的免疫分析方法，通过待测样品与铬完全抗原竞争结合胶体金偶联辣根过氧化物酶和抗铬 单克隆抗体复合物并通过显色反应放大信号实现对待测样品中铬含量的检测。本发明实施 例提供的一种检测铬的免疫分析方法为一步法竞争酶联免疫分析方法，简便、快速且能够 高通量检测。本发明实施例还提供了一种检测铬（包括三价铬、六价铬和总铬）的免疫分 析检测试剂盒。
[0006] 本发明实施例第一方面提供了一种检测铬（包括三价铬、六价铬和总铬）的免疫 分析方法，包括以下步骤：
[0007] (1)取铬检测用完全抗原，用碳酸盐缓冲液进行稀释，将稀释后的铬完全抗原包被 至固相载体表面，4°c包被过夜，随后用洗涤缓冲液洗涤所述固相载体并甩干；
[0008] (2)随后加入封闭缓冲液封闭所述固相载体表面的空余间隙，37 °C封闭 0. 5-3h(优选lh)，随后用洗涤缓冲液洗涤所述固相载体并甩干；
[0009] (3)取已预处理的待测样品，加入至步骤（2)获得的固相载体表面，以及取浓度梯 度的铬标准溶液按照所述待测样品的方法设置标准曲线；
[0010] (4)取胶体金颗粒偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体的复合物，与步骤（3) 中获得的固相载体上包被的所述铬完全抗原和所述铬标准溶液或所述待测样品反应连接， 37°C反应30min，随后用洗涤缓冲液洗涤所述固相载体并甩干；
[0011] (5)通过加入辣根过氧化物酶显色剂进行显色反应并测定光密度值或通过加入辣 根过氧化物酶发光剂进行发光反应测定光信号，根据所述铬标准溶液所测得的吸光值绘制 标准曲线，计算待测样品中锌的含量；
[0012] 上述步骤中，所述碳酸盐缓冲液的浓度为0. 05M且pH值为9. 6,所述洗涤缓冲液含 有浓度为〇.015M且pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液和质量浓度为0. 05%的吐温20,所述封闭 缓冲液中含有质量浓度为1%的小牛血清白蛋白或质量浓度为5%的脱脂奶粉且所述封闭 缓冲液的pH值为7. 4,所述稀释缓冲液为pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液。
[0013] 步骤（1)中，优选地，所述固相载体为聚苯乙烯酶标板、聚苯乙烯珠、尼龙膜、聚偏 氟乙烯膜、硝酸纤维素膜或磁性微珠。
[0014] 优选地，所述铬完全抗原的浓度为250ng/mL。
[0015] 优选地，所述铬完全抗原由具有硫氰基的双功能螯合剂将铬离子与载体蛋白连接 形成，所述双功能螯合剂的一端与所述锌离子通过化学键连接，所述双功能螯合剂的另一 端的硫氰基与所述载体蛋白的氨基偶联。
[0016] 优选地，所述具有硫氰基的双功能螯合剂为1- (4-异硫氰苄基）乙烯基二 胺-N,N,N,N-四乙酸（Isothiocyanobenzyl-EDTA简称iEDTA)或p-SCN-Bn-DTPA，
[0017] 优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)。
[0018] 优选地，所述铬完全抗原的制备方法包括以下步骤：
[0019] 1)制备双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基）乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸（iEDTA) 溶液；
[0020] 2)将含有铬离子的溶液逐滴加入到所述1-(4-异硫氰苄基）乙烯基二 胺-N，N，N，N-四乙酸（iEDTA)溶液中，室温下反应3~24h，制得铬离子-双功能螯合剂复 合物，所述铬离子与所述1-(4-异硫氰苄基）乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸（iEDTA)的物 质的量比例为1:1 ;
[0021] 3)将所述铬离子-双功能螯合剂复合物逐滴加入到pH值为7. 4的含有载体蛋 白的缓冲体系中制得反应混合液，调节所述反应混合液的pH值为9. 0~9. 5,室温下反应 12~24h，反应结束后离心超滤或透析除去未反应的铬离子和双功能螯合剂，制得铬完全 抗原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)，加入的所述载体蛋白（BSA) 与所述铬离子的物质的量比例为1:20~1:50,加入的所述载体蛋白（OVA)与所述铬离子的 物质的量比例为1:10~1:20 ;所述铬完全抗原由具有硫氰基的双功能螯合剂将铬离子与 载体蛋白连接形成，所述双功能螯合剂的一端与所述铬离子通过络合作用连接，所述双功 能螯合剂的另一端的硫氰基与所述载体蛋白的氨基偶联。
[0022] 步骤（3)中，优选地，所述样品前处理过程包括以下步骤：
[0023] (1)将采集的环境水样经滤纸过滤，做好标签，于4°C保存；
[0024] (2)①检测三价铬：往样品中加入乙二胺四乙酸（EDTA)溶液，螯合水样中三价铬 离子，用于三价铬浓度的测定；②检测六价铬：往样品中加入氢氧化钠（NaOH)溶液，调节 其pH至9左右，沉淀除去样品中三价铬离子；转移上层清液，再加入等体积的亚硫酸氢钠 (NaHS03)或焦亚硫酸钠（Na2S205)和EDTA的混合溶液，将六价铬还原成三价铬，并被EDTA螯 合形成三价铬-EDTA复合物；③检测总铬：往样品中加入等体积的亚硫酸氢钠（NaHS03)或 焦亚硫酸钠（Na2S205)和EDTA的混合溶液，将六价铬还原成三价铬，并被EDTA螯合形成三 价铬-EDTA复合物。
[0025] 上述步骤中，所述滤纸为0.22~0.45yM，所述乙二胺四乙酸溶液的终浓度为 0. 5mM~10mM，所述亚硫酸氢钠溶液的终浓度为60~180yg/mL，所述焦亚硫酸钠溶液的终 浓度为 54. 8 ~164. 4yg/mL。
[0026] 优选地，所述铬标准溶液的浓度梯度均为0? 5, 1，2, 5, 10, 20, 50, 100, 200ng/mL。
[0027] 步骤（4)中，优选地，所述胶体金颗粒偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体复 合物的制备方法包括以下步骤：
[0028] 1)将超纯水加入到洁净干燥的烧瓶中，随后加入氯金酸溶液，置于加热搅拌器上 直至溶液沸腾后，迅速加入柠檬酸三钠溶液，待反应液颜色稳定后停止加热，室温静置冷 却，制得胶体金颗粒，所述胶体金颗粒溶液为红色，颗粒直径为20~40nm;
[0029] 2)将所述胶体金颗粒溶液，用碳酸钾溶液调节其pH为8. 2~8. 5,将按比例混合 的抗铬单克隆抗体和辣根过氧化物酶逐滴加入到所述胶体金溶液中，室温反应20min后， 静置2h;
[0030] 3)随后加入封闭缓冲液，室温静置反应30min封闭所述胶体金颗粒表面的空余间 隙；
[0031] 4)随后在4°C条件下离心，并用洗涤缓冲液洗涤所述胶体金颗粒；最后用重悬缓 冲液将所述胶体金颗粒充分重悬，制得抗铬单克隆抗体-胶体金颗粒-辣根过氧化物酶复 合物；
[0032] 上述步骤中，所述氯金酸溶液质量分数为0. 01 %~1 %，所述柠檬酸三钠溶液质 量分数为1 %，所述碳酸钾溶液物质的量浓度为〇. 1~〇. 5mol/L，所述辣根过氧化物酶和抗 铬单克隆抗体的物质的量比例