[0078] 实施例5
[0079] 实际样品中重金属铬包括总铬、三价铬、六价铬的前处理方法分别如图5、图6和 图7所示，包括以下步骤：
[0080] (1)将采集的环境水样经0. 45yM的滤纸过滤，做好标签，于4°C保存；
[0081] (2)如图5所示检测总铬：往样品中加入等体积、终浓度为60yg/mL亚硫酸 氢钠（NaHS03)和终浓度为0. 5mMEDTA的混合溶液，将六价铬[Cr(VI)]还原成三价铬 [Cr(III)]，并被EDTA螯合形成三价铬-EDTA复合物[Cr(III) -EDTA]。
[0082] 如图6所示的检测三价铬：往样品中加入终浓度为0. 5mM的乙二胺四乙酸（EDTA) 溶液，螯合水样中三价铬离子[Cr(III)]形成三价铬-EDTA复合物[Cr(III)-EDTA]，六价铬 离子[Cr(VI)]不会跟EDTA螯合，EDTA也会螯合其他材料（图中白色球代表其他物质）， 但不影响三价铬的检测。
[0083] 如图7所示的检测六价铬：往样品中加入氢氧化钠（NaOH)溶液，调节其pH至9左 右，沉淀除去样品中三价铬离子[Cr(III)];转移上层清液，再加入等体积、终浓度为60yg/ mL亚硫酸氢钠（NaHS03)和终浓度为0. 5mMEDTA的混合溶液，将六价铬[Cr(VI)]还原成 三价铬[Cr(III)]，并被EDTA螯合形成三价铬-EDTA复合物[Cr(III) -EDTA]，当然与EDTA 结合的还可能是其他物质（图中白色球所表示），但不影响铬元素的检测；
[0084] 效果实施例1
[0085] 本效果实施例1采用国家标准水质样品，包括六价铬标准样品 (GSBZ50027-94, 0? 099 ±0. 006mg/L)和总铬标准样品（GSB07-1187-2000, 0? 747 ±0. 028mg/ L)检测本发明实施例4和实施例5的样品前处理效果和检测结果，其检测结果如表1所示。
[0086] 表1、本发明效果实施例1提供的标准样品检测结果对比表。
【主权项】
1. 一种检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 取铬检测用完全抗原，用碳酸盐缓冲液进行稀释，将稀释后的铬完全抗原包被至固 相载体表面，4°C包被过夜，随后用洗涤缓冲液洗涤所述固相载体并甩干； (2) 随后加入封闭缓冲液封闭所述固相载体表面的空余间隙，37°C封闭0.5-3h，随后 用洗涤缓冲液洗涤所述固相载体并甩干； (3) 取已预处理的待测样品，加入至步骤（2)获得的固相载体表面，以及取浓度梯度的 铬标准溶液按照所述待测样品的方法设置标准曲线； (4) 取胶体金颗粒偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体的复合物，与步骤（3)中获 得的固相载体上包被的所述铬完全抗原和所述铬标准溶液或所述待测样品反应连接，37°C 反应30min，随后用洗绦缓冲液洗绦所述固相载体并甩干； (5) 通过加入辣根过氧化物酶显色剂进行显色反应并测定吸光度值或通过加入辣根过 氧化物酶发光剂进行发光反应测定光信号，根据所述铬标准溶液所测得的吸光值绘制标准 曲线，计算待测样品中铬的含量。
2. 如权利要求1所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述铬完全抗原 的浓度为250ng/mL ;所述碳酸盐缓冲液的浓度为0. 05M且pH值为9. 6,所述洗涤缓冲液含 有浓度为〇. 015M且pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液和质量浓度为0. 05%的吐温20 ;所述封闭 缓冲液中含有质量浓度为1%的小牛血清白蛋白或质量浓度为5%的脱脂奶粉且所述封闭 缓冲液的pH值为7. 4 ;所述铬标准溶液的浓度梯度均为0. 5, 1，2, 5, 10, 20, 50, 100, 200ng/ mL〇
3. 如权利要求2所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述铬完全抗原 由具有硫氰基的双功能螯合剂将铬离子与载体蛋白连接形成，所述双功能螯合剂的一端与 所述铬离子通过化学键连接，所述双功能螯合剂的另一端的硫氰基与所述载体蛋白的氨基 偶联。
4. 如权利要求3所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述具有硫氰基 的双功能螯合剂为1- (4-异硫氰苄基）乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸或p-SCN-Bn-DTPA，所 述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5. 如权利要求4所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述铬完全抗原 的制备方法包括以下步骤： (1) 制备双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基）乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸溶液； (2) 将含有铬离子的溶液逐滴加入到所述1-(4-异硫氰苄基）乙烯基二 胺-N，N，N，N-四乙酸溶液中，室温下反应3~24h，制得铬离子-双功能螯合剂复合物，其 中，所述铬离子与所述1-(4-异硫氰苄基）乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸的物质的量比例 为 1:1 ; (3) 将所述铬离子-双功能螯合剂复合物逐滴加入到pH值为7. 4的含有载体蛋白的 缓冲体系中制得反应混合液，调节所述反应混合液的pH值为9. 0~9. 5,室温下反应12~ 24h，反应结束后离心超滤或透析除去未反应的铬离子和双功能螯合剂，制得铬完全抗原； 其中，当载体蛋白为牛血清蛋白时，所述载体蛋白与所述铬离子的物质的量比例为1:20~ 1:50,当载体蛋白为卵清蛋白时，所述载体蛋白与所述铬离子的物质的量比例为1:10~ 1:20〇
6. 如权利要求5所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述胶体金颗粒 偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体复合物的制备方法包括以下步骤： (1) 将超纯水加入到烧瓶中，随后加入氯金酸溶液，置于加热搅拌器上直至溶液沸腾 后，迅速加入柠檬酸三钠溶液，待反应液颜色稳定后停止加热，室温静置冷却，制得胶体金 颗粒； (2) 调节所述胶体金颗粒溶液pH为8.2~8.5,将按比例混合的抗铬单克隆抗体和辣 根过氧化物酶逐滴加入到所述胶体金溶液中，室温反应20min后，静置2h ; (3) 随后加入封闭缓冲液，室温静置反应30min封闭所述胶体金颗粒表面的空余间隙； (4) 随后在4°C条件下离心，并用洗涤缓冲液洗涤所述胶体金颗粒；最后用重悬缓冲液 将所述胶体金颗粒充分重悬，制得抗铬单克隆抗体-胶体金颗粒-辣根过氧化物酶复合物。
7. 如权利要求6所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述胶体金颗粒 偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体复合物的制备方法中，所述氯金酸溶液质量分数 为0.0 l %~1 %，所述柠檬酸三钠溶液质量分数为1 %，所述碳酸钾溶液物质的量浓度为 0. 1~0. 5mol/L，所述辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体的物质的量比例为1:1~1:24， 所述封闭缓冲液为质量浓度1 %的牛血清白蛋白溶液，所述洗涤缓冲液为〇. OlM pH 7. 4 的磷酸缓冲液，所述重悬缓冲液为含5% m/v海藻糖和质量浓度为1%的牛血清白蛋白的 0. 015M pH7. 4的磷酸盐缓冲液。
8. 如权利要求7所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述胶体金颗粒 偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体的浓度为I :1000稀释。
9. 如权利要求8所述的检测重金属铬的免疫分析方法，其特征在于，所述样品预处理 过程包括以下步骤： (1) 将采集的环境水样经滤纸过滤，做好标签于4°C保存； (2) 往样品中加入乙二胺四乙酸溶液，螯合水样中三价铬离子，用于三价铬浓度的测 定； 或者往样品中加入氢氧化钠溶液，调节其PH至9,沉淀除去样品中三价铬离子，转移上 层清液，再加入等体积的亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠和EDTA的混合溶液，将六价铬还原成三 价铬，并被EDTA螯合形成三价铬-EDTA复合物，用于六价铬浓度的测定； 或者往样品中加入等体积的亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠和EDTA的混合溶液，将六价铬 还原成三价铬，并被EDTA螯合形成三价铬-EDTA复合物，用于检测总铬； 上述步骤中，所述滤纸为0. 22~0. 45 y M，所述乙二胺四乙酸溶液的终浓度为0. 5mM~ 10mM，所述亚硫酸氢钠溶液的终浓度为60~180 y g/mL，所述焦亚硫酸钠溶液的终浓度为 54. 8 ~164. 4 y g/mL。
10. -种检测重金属铬的免疫分析检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有铬完全抗原 的固相载体、铬标准溶液和胶体金颗粒偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体复合物溶 液，以及包括辣根过氧化物酶显色剂和终止液。
【专利摘要】本发明提供了一种检测重金属铬的免疫分析方法及免疫分析检测试剂盒，本发明通过胶体金颗粒偶联辣根过氧化物酶和抗铬单克隆抗体，形成酶标记复合物，建立检测方法；通过预处理样品中的铬与检测抗原竞争结合酶标记抗体复合物，经显色反应放大信号实现对待测样品中铬含量的检测。本发明的检测铬的免疫分析方法为一步法竞争酶联免疫分析方法，是一种简便、快速且能够高通量的检测方法。
【IPC分类】G01N33-535, G01N33-577
【公开号】CN104849447
【申请号】CN201510248885
【发明人】钟松清, 江天久, 谭攀, 唐勇, 邹军辉, 谢冬霞, 刘家飞
【申请人】深圳市三方圆生物科技有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月15日