D-二聚体近红外荧光法检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别是设及一种D-二聚体近红外法巧光检测试剂盒 及其用途。
【背景技术】
[000引D-二聚体是交联纤维特异性降解产物，也是继发性纤溶特有代谢产物。D-二聚 体是在各种病理或生理状态下，凝血系统激活导致凝血活酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白 体，并在活化因子XIII的作用下形成交联纤维蛋白。D-二聚体是交联纤维蛋白在纤溶酶讲 解过程中所释放碎片进一步降级产生的含有丫链的片段。受到病理因素影响，机体凝血及 纤溶动态平衡遭到破坏，凝血倾向不断增加，从而导致纤维蛋白降解产物增加。因此，D-二 聚体含量升高，表明机体内存在纤维蛋白血栓形成和纤溶发生，临床上也将D-二聚体含量 的变化作为机体高凝状态与纤溶亢进状态的分子标志物。
[0003]D-二聚体的检测是临床对继发性纤溶灵敏度较高、特异性强的检验项目，是目前 判断机体高凝状态和鉴别原发性与继发性纤溶、观察溶栓治疗效果等方面有重要临床价值 的指标。D-二聚体的检测有重大的临床应用价值；可用于弥漫性血管内凝血值1C)的早期 诊断，深静脉血栓值VT)及肺栓塞的筛查，急性脑梗死的早期诊断、治疗和愈后观察，肝病 的治疗和诊断及对恶性肿瘤的疗效和愈后观察等。
[0004] 因此，对D-二聚体的快速、全面、准确、特异检测显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种D-二聚体近红外巧 光法检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的D-二聚体近红外巧光检测技术，解决现有 技术中的问题。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外巧光检测技术，可快速，准确的检测 出人全血/血清/血浆中D-二聚体。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用W下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面提供一种D-二聚体近红外巧光法检测试剂盒，包括位于背板 上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫巧光探针的玻璃纤维素膜、包 被有抗D-二聚体单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。
[000引优选的，所述免疫巧光探针为抗D-二聚体单克隆抗体包被的近红外巧光乳胶微 球颗粒。
[0009] 优选的，硝酸纤维素膜上包被的抗D-二聚体单克隆抗体和所述近红外巧光乳胶 微球颗粒上包被的抗D-二聚体单克隆抗体可W为相同的抗D-二聚体单克隆抗体，也可W 为不同的抗D-二聚体单克隆抗体。
[0010] 更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam嚴Anti-D-Dimer抗体巧D1]，所述近红外巧光乳胶微球颗粒上包被的抗D-二聚体单克 隆抗体为Abeam盛Anti-D-Dimer抗体巧D1]，或所述硝酸纤维素膜上包被的Abeam? Anti-D-Dimer抗体巧Dl]，所述近红外巧光乳胶微球颗粒上包被的抗D-二聚体单克隆抗体 为Abeam篡Anti-D-Dimer抗体I!孤2]。
[0011] 更优选的，所述巧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
[001引近红外光（NIR)，是介于可见光（VI巧和中红外光（MIR)之间的电磁波，ASTM定义NIR为波长在780nm-2526皿范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或巧光强度很 小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大 为减少。
[0013] 本发明的第二方面提供所述D-二聚体近红外巧光法检测试剂盒的制备方法，包 括如下步骤：
[0014] 1)用缓冲液将巧光乳胶微粒离屯、清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分 散液中加入抗D-二聚体单克隆抗体；加入邸CA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳 胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；
[0015] 2)将含有抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；
[0016]扣将步骤1)制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
[0017] 4)将步骤2)所得的硝酸纤维素膜、步骤3)所得的标记有免疫巧光探针的玻璃纤 维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成D-二聚体近红外巧光检测试剂盒。
[0018] 优选的，所述步骤1)中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠離， 制备获得探针溶液，所述冠離选自二环已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一种 或多种的组合。
[0019] 更优选的，步骤1)制备获得的探针溶液中冠離的浓度为0.l-20mg/ml，更优选为 4-8mg/ml。
[0020] 优选的，所述步骤1)中，缓冲液为磯酸盐（PB巧缓冲液。
[002U 更优选的，所述PBS缓冲液为0. 009-0.0 llmol/L，PH7. 25-7. 35的PBS缓冲液。
[0022] 优选的，所述步骤1)中，巧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
[0023] 优选的，所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗D-二聚体单克隆抗体、邸CA的重量比为 9-11 ;0. 9-1. 1 ;0. 9-1. 1。
[0024] 在本发明一优选实施例中，乳胶颗粒、抗D-二聚体单克隆抗体、邸CA的投料量分 别为lmg、100ug、100ug。
[0025] 优选的，所述封闭液为己醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调 整己醇胺的用量。
[0026] 优选的，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
[0027] 本领域技术人员可选取适当浓度和抑的PBS缓冲液，更优选为0. 009-0.0 llmol/ L，PH7. 25-7. 35 的PBS缓冲液。
[002引优选的，所述步骤2)中，含有抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠離， 所述冠離选自二环已基-18-冠-6、15-冠離-5、18-冠離-6中的一种或多种的组合。
[0029] 更优选的，所述含有抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液中冠離的浓度为 0.l-20mg/ml，更优选为 4-8mg/ml。
[0030] 优选的，所述步骤2)中，含有抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液中抗D-二聚体 单克隆抗体的浓度为1. 8-2. 2mg/ml。
[0031] 优选的，所述步骤2)中，抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为 0. 9-1. lul/cm。
[0032] 优选的，所述步骤2)中，烘干的具体条件为36-38°C烘箱烘干。
[0033] 所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。
[0034] 优选的，所述步骤1)中的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam恋Anti-D-Dimer抗体 曲)1]，所述步骤2)中的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam?Anti-D-Dimer抗体曲)1]，或 所述步骤1)中的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam?Anti-D-Dimer抗体巧D1]，所述步骤 2)中的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam嚴Anti-D-Dimer抗体脚)2]。
[0035] 优选的，所述步骤3)中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。
[0036] 本发明的第S方面提供了所述D-二聚体近红外巧光法检测试剂盒在D-二聚体检 测领域的用途。
[0037] 所述用途具体为使用所述D-二聚体近红外巧光法检测试剂盒对样品中的D-二聚 体进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中的一种或多种的组合。
[003引本发明所提供的检测试剂盒W人全血/血清/血浆为检测样本，结合近红外巧光 检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中的D-二聚体。所述试剂盒采用免疫巧光层析 法，其最小可测量可达2.Oug/l，检测方便、成本低，灵敏度高，特异性好，比同类定量诊断试 剂价格低20-30%，大大节约了社会医疗成本，检测过程中样品收集及处理简单，可快速准 确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中，为临床治疗提 供定性依据。
【具体实施方式】
[0039]W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可W通过另外不同的具体实 施方式加W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0040] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"该个"包括复数形式。
[0041] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0042] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。该些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等MOLECULAR CLONING ;A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and "Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, J