ohn Wiley&Sons，New York,1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND即NCTION，Iliird edition，Academic Press，San Diego, 1998 ;MET册DS IN ENZYMOLOGY，Vol. 304，Qiromatinf.M.Wassarman and A. P.Wolffe，eds.)，Academic Press, San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, Chromatin Protocols (P. B. Becker, ed.)Humana Press, Totowa，1999等。
[0043] 本发明各实施例中试验样品由浦东新区人民医院提供。近红外巧光检测仪，由上 海凯创生物技术有限公司开发提供。
[0044] 实施例1
[0045] 1.免疫巧光抗D-二聚体抗体颗粒制备；
[0046] 用0.Olmol/L，PH7. 3 + 0. 05的磯酸盐缓冲液将直径为150皿的巧光乳胶微粒离 屯、清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入Abeam篡Anti-D-Dimer抗体 巧D1];加入邸CA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，再加入二环 已基-18-冠-6。按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微克的邸CA用量标记。每 毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的己醇胺当量的封闭液进行封闭，冠離的终浓度为 6mg/ml〇
[0047] 2.试剂盒的制备：
[0048]用0. 01M pH7. 2的PBS缓冲液稀释Abeam? Anti-D-Dimer抗体[孤1]至浓度 2. Omg/ml，并加入冠離，冠離的终浓度为6mg/ml，再利用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适 当孔径的硝酸纤维素膜上，按lul/cm的量进行喷膜，37°C烘箱烘干备用。
[0049] 用制备好的探针（步骤1制得的标记有Abeam坂Anti-D-Dimer抗体巧D1]的近 红外巧光乳胶微球）溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用。
[0050] 将包被抗D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫巧光探针的玻璃纤维素膜、 样品垫、吸水纸及背板组装制备成D-二聚体近红外巧光法检测试剂盒。
[0化1]实施例2[00巧试剂盒检测；
[005引 W基因工程合成的D-二聚体和PBS缓冲液分别配置浓度为lug/L、化g/L、4ug/L、 10ug/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L、300ug/L、400ug/L、500ug/L、1000ug/L的D-二 聚体标准品，WOug/L作为空白对照，空白对照及每个浓度的标准品均重复测定6次。标 准品及试剂盒均平衡至室温后再开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本 (约120-150U1)。15分钟时，用近红外巧光检测仪检测巧光信号，并用巧光仪器进行判断， 分析仪的对巧光信号的检测范围是AD值0-10000。WD-二聚体浓度为横坐标，近红外巧光 检测仪检测巧光信号（平均值）为纵坐标，建立标准曲线。在标准曲线上，随着标准品浓度 的升高，测得的巧光信号值也随之升高。
[0化4] 根据标准曲线计算可知，本试剂盒对1.Oug/L的样品可W部分检出，对2.Oug/L的 样品全部检出，其最低检出限《2.Oug/L，并在2-lOOOug/L的范围具有良好的线性。
[0化5]各浓度的批内最大eVs为4.0%，平均eVs为3. 51% (每个浓度的样品同批进行 测试），各浓度的批间最大CVs为5. 3%，平均CVs为4. 1 % (每个浓度的样品分5批进行测 试）表明本发明所提供的试剂盒具有良好的重复性。
[0056] 选择未检测出D-二聚体进行加标回收实验，加入D-二聚体标准品，将D-二 聚体的浓度分别调整至20ug/L、50ug/L、100ug/l，空白对照及每个浓度的样品均重复测 定6次。各浓度的批内最大CVs为4. 2 %，平均CVs为3. 5 %，各浓度的加标回收率为 97. 1% -100. 3%，表明本发明所提供的试剂盒具有良好的准确度。
[0化7] 将本发明所提供的D-二聚体近红外巧光法检测试剂盒密封保存，并存放于4°C及 室温（25°C左右）下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。保存于4°C的试剂盒每周 取出4盒，分别检测lug/L、化g/L、4ug/L、10ug/L的D-二聚体标准品；保存于室温（25°C) 的试剂盒每3天取出4盒，分别检测lug/L、化g/L、4ug/L、10ug/L的D-二聚体标准品。经 验证，试纸盒在4°C下可保存24个月，且最低检出限和重复性没有明显变化，在室温下可 保存18个月，且最低检出限和重复性没有明显变化；在可保存的期限内，试剂盒均可达到 《2.Oug/L的检测灵敏度。
[005引综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。[0化9] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种D-二聚体近红外荧光法检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样 端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗D-二聚体单克隆抗 体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗D-二聚体单克隆抗体包被的近红外 荧光乳胶微球颗粒。
2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗 D-二聚体单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗D-二聚体单克隆抗体为 相同的抗D-二聚体单克隆抗体，或者为不同的抗D-二聚体单克隆抗体。
3. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗 D-二聚体单克隆抗体为Abcanr? Anti-D-Dimer抗体[DD1]，所述近红外焚光乳胶微球颗粒 上包被的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam? Anti-D-Dimer抗体[DD1]，或所述硝酸纤维素 膜上包被的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam? Anti-D-Dimer抗体[DD1]，所述近红外焚光 乳胶微球颗粒上包被的抗D-二聚体单克隆抗体为Abeam? Anti-D-Dimer抗体[DD2]。
4. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为 140_160nm。
5. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤： 1) 用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液 中加入抗D-二聚体单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗 粒上多余的基团，制备获得探针溶液； 2) 将含有抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用； 3) 将步骤1)制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用； 4) 将步骤2)所得的硝酸纤维素膜、步骤3)所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素 膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成D-二聚体近红外荧光检测试剂盒。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，再加入封闭液封闭乳 胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、 15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0. l-20mg/ml ; 和/或，所述步骤1)中，缓冲液为PBS缓冲液； 和/或，所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗D-二聚体单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11 : 0. 9-1. 1 ：0. 9-1. 1 ； 和/或，所述封闭液为乙醇胺。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，含有抗D-二聚体单 克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠 醚-6中的一种或多种的组合； 和/或，所述含有抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0. l-20mg/ml ; 和/或，含有抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液中抗D-二聚体单克隆抗体的浓度为 1. 8-2. 2mg/ml ； 和/或，抗D-二聚体单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0. 9-1. lul/cm ; 和/或，所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
8. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的检测试剂盒在D-二聚体检测领域的用途。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述用途具体为使用所述D-二聚体近红 外荧光法检测试剂盒对样品中的D-二聚体进行检测，所述样品选自人全血、血清或血浆中 的一种或多种的组合。
【专利摘要】本发明公开了一种D-二聚体近红外荧光法检测试剂盒及其用途。本发明提供的一种D-二聚体近红外荧光法检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出人全血、血清或血浆中的D-二聚体。
【IPC分类】G01N33-577
【公开号】CN104865382
【申请号】CN201510292033
【发明人】李林
【申请人】上海凯创生物技术有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月1日