一种磁性纳米颗粒生物探针及其制备方法和应用
【专利说明】一种磁性纳米颗粒生物探针及其制备方法和应用 技术领域
[0001] 本发明属于生物技术与纳米材料技术领域，具体涉及一种用于检测HBV preSl抗 原的磁性纳米颗粒生物探针、磁性免疫层析试纸条及其制备方法和使用方法。 【背景技术】
[0002] 乙型肝炎（HBV)是我国的高发病，我国人群中感染率达60%，且呈逐年上升趋势， HBV表面抗原携带者有1. 3亿以上，10%以上转为慢性肝炎，部分演变为肝硬化，进而引 发肝癌。因此，对乙肝病毒在体内是否有复制的准确判断及抗病毒治疗后的准确监测就显 得特别重要。临床上应用乙肝五项血清学指标及其模式的动态变化，监测、监控HBV感染者 的病情，判断感染者的传染性和评价抗病毒药物的治疗效果。20世纪80年代末期，随着 PCR技术的出现及成熟，HBV-DNA定量已经成为乙型肝炎诊断的金标准，但是PCR技术由于 其实验要求的高标准及高成本，使其推广利用大大受限。
[0003] 国内外近年来的研宄表明，HBV前SI (preSl)抗原是病毒存在和复制的又一新标 志，Pre-SlAg出现在急性HBV感染的最早期，并与HBV核心抗原（HBeAg)及HBV DNA显著相 关。前Sl抗原与HBV-DNA检出率两者符合，前Sl抗原仅在HBV-DNA阳性血清中检出。前 Sl蛋白随HBeAg消失而消失，且与阴转时间呈正相关，这样，前Sl抗原可作为病毒清除与 病毒转阴的指标。前Sl抗原阳性的乙型肝炎患者传播乙型肝炎病毒比前Sl抗原阴性和无 症状HbsAg携带者的危险性更大，因而说明前Sl抗原可反映乙型肝炎病毒复制和传染性的 指标。如果前Sl抗原持续阳性，指示AHB向慢性转变。比较急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、 和HBsAg阳性的患者血清中前Sl蛋白，前Sl抗原阴转愈早，AHB患者的疗程愈短，预后也 愈好。说明前Sl抗原及其抗体的检测是急性乙型肝炎的临床诊断，疗效观察和判数据预后 的良好指标。
[0004] 一直以来，在中国检测HBV采用的是传统的ELISA检测，由于ELISA检测成本低， 收费低，病人负担相对较小。所以对于采用化学发光和电化学发光检测来说很难全面的推 广到各地区的医院，虽然化学发光和电化学发光检测相对于传统的ELISA方法检测HBV具 有明显检测灵敏度和检测线性的优势，对于相同类的竞争化学发光和时间分辨荧光来说， 也具有设备更稳定，结果更稳定的优势，但是操作步骤和检测时间与传统ELISA方法相比 并没有简化太多，检测成本昂贵，对临床检验医师的技术要求也比较高，限制了其在临床的 推广使用。
[0005] 磁性纳米探针法免疫层析检测技术是借鉴目前已经成熟的免疫胶体金层析技术 的基本原理，以磁性纳米材料代替胶体金颗粒利用抗体、抗原在试纸条上的夹心反应，实现 磁性纳米探针标记乙肝前Sl抗原的检测技术，既克服了目前免疫胶体金层析技术定量困 难、检测灵敏度低的不足，又具有快速、灵敏、高特异性，并可以实现定量检测，是一种适合 于现场检测的快速检测技术，具有很好的发展趋势和应用前景。
[0006] 磁性纳米材料是以具有超顺磁性的铁氧化物(多为四氧化三铁）为内核，以氧化硅 为壳层，当该铁氧化物颗粒体积减小到某一数值时，热扰动能将与总的磁晶各向异性能相 当，这样，颗粒内的磁矩方向就可能随着时间的推移，整体保持平行地在一个易磁化方向和 另一个易磁化方向之间反复变化。从单畴颗粒集合体看，就具有超顺磁性。在单畴颗粒集 合体出现超顺磁性的温度范围内，分别在不同的温度下测量其磁化曲线，这些磁化曲线必 定是重合在一起的，且不会出现磁滞，即集合体的剩磁和矫顽力都为零。这种超顺磁性也是 磁性纳米材料的生物医学应用的基本保障。
[0007] 由于磁性纳米探针法检测HBV preSl抗原可以做到病毒定量检测，因此临床医生 可以根据HBV病毒的量的变化分析病人的病情发展，从而更好的知道临床医生的合理用 药，节省病人对乙肝治疗的费用，尤其是对慢性乙肝更具有长期的监测作用。当然因其高的 灵敏度，使得磁性纳米探针法检测HBV preSl抗原，可以提高乙肝的检测率，使检测的窗口 期提前，防止出现ELISA法的假阴性而漏检，所以磁性纳米探针法检测HBV preSl抗原还可 以广泛用于体检的检测。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术中"两对半"试剂不能很好的反映乙肝病毒的存在状况，不能定 量检测HBV，而HBV-DNA定量PCR检测实验成本高、耗时长的缺陷，本发明提供一种用于检 测HBV preSl抗原的磁性纳米颗粒生物探针、磁性免疫层析试纸条及其制备方法和使用方 法，其磁性纳米颗粒生物探针具有特异性强，信号灵敏且稳定性好的特点，其的磁性免疫层 析试纸条可以实现对人外周血清中HBV preSl抗原的快速定性和定量检测。
[0009] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现： 一种磁性纳米颗粒生物探针的制备方法，具体包括以下步骤： 步骤1)对粒径为100-200nm的磁性纳米颗粒进行表面氨基化处理，得到表面氨基化的 磁性纳米颗粒；再对所述表面氨基化的磁性纳米颗粒进行羧基化处理，得表面羧基化的磁 性纳米颗粒；步骤2)在缓冲液中将所述表面羧基化的磁性纳米颗粒、碳化二亚胺（EDC，又 称碳二亚胺）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)混合反应，反应后洗涤，得反应物A ; 步骤3)在偶联缓冲液中将所述反应物A和HBV preSl的抗体混合反应，得反应物B ; 步骤4)将所述反应物B与含氨基的化合物的溶液混合反应，反应后洗涤，即制得磁性 纳米颗粒生物探针。
[0010] 进一步的，步骤1)中，所述磁性纳米颗粒可为纳米材料领域中常规的磁性纳米 颗粒；所述磁性纳米颗粒具有超顺磁性；所述磁性纳米颗粒的比饱和磁化强度较佳地在 25-45emu/g ;所述磁性纳米颗粒较佳地为具有核壳结构的磁性粒子/氧化娃复合材料，即： 所述的磁性纳米颗粒的内核为磁性粒子，所述的磁性纳米颗粒的壳层为氧化硅；所述磁性 粒子较佳地为铁氧化物，如四氧化三铁。所述磁性粒子/氧化硅复合材料的壳层的厚度较 佳地为5-50nm。
[0011] 其中，所述磁性粒子可按现有文献制备，例如：Magnetite Nanocrystal Clusters with Ultra-High Sensitivity in Magnetic Resonance Imagin (Fangjie Xu，Changming Cheng，Du-Xing Chen，Hongchen Gu，Chemphyschem，2012，13,336_341)D 所述磁性粒 子/氧化娃复合材料可按现有文献制备，例如：Synthesis of Magnetic Microspheres with Immobilized Metal Ions for Enrichment and Direct Determination of Phosphopeptides by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (Xiuqing Xu，Chunhui Deng，Mingxia Gao,Wenjia Yu，Pengyuan Yang，and Xiangmin Zhang，Advanced Materials，2006,18,3289-3293.)。
[0012] 进一步的，所述磁性纳米颗粒优选采用以下方法制得： (1)用溶剂热法制备磁性粒子： 将无机铁盐、稳定剂和乙二醇混合，于180-220°C下反应8-24小时，洗涤，即得磁性粒 子；所述的稳定剂为柠檬酸钠或聚丙烯酸（PAA); 其中，所述的洗涤较佳地是在磁分离的辅助下用乙醇和/或去离子水洗涤多次；其中， 所述的溶剂热法为本领域常规的制备磁性粒子的方法；按本领域常识，所述的反应在弱碱 性条件下进行，当所述的稳定剂为聚丙烯酸时，在所述的混合时较佳地还添加尿素以控制 反应体系的pH值； (2 )氧化娃包被磁性粒子： 将上述制得的磁性粒子和〇. 8-1. 2mol/L的强酸溶液混合，超声10-40分钟，在磁分离 的辅助下用去离子水洗涤5-7次，得活化后的磁性粒子；将所述活化后的磁性粒子和醇水 混合液混合，在搅拌状态下加入碱和正硅酸烷基酯，所加入的碱使得混合后体系的pH值在 8. 0-10. 5,反应8-24小时，在磁分离的辅助下用醇洗涤3-5次，即制得所述磁性纳米颗粒； 其中，所述正硅酸烷基酯的用量为20-500 μ L/100mg所述磁性粒子；所述醇水混合液 中的醇水比例为60:40-90:10 ;所述的强酸为本领域常规使用的酸，一般为盐酸；其中，所 述的碱为本领域常规使用的碱，较佳地为NH3 · H20 ;所述的醇水混合液中的醇可为本领域 常规使用的任意醇；所述的醇可为本领域常规使用的醇，较佳地为乙醇。按本领域常识，所 述的正硅酸烷基酯可以分多批添加，