一种定量检测牛乳β-乳球蛋白的双抗体夹心法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种定量检测牛乳e -乳球蛋白的双抗 体夹心法。
【背景技术】
[0002] 在中国，近年来，由于人们越来越意识到牛乳对人体健康的重要性，牛奶制品已经 成为人民的生活必需品，市场对牛奶制品的需求量也在持续增长。尽管生乳总产量的基数 已在1596. 03万吨以上，而且每年以10%以上的速度继续递增，但乳品行业仍然处于奶源不 足的状况，在巨大经济利益的驱使下，乳品的掺假现象也越来越严重。牛乳掺假主要包括： 一是原料奶中掺假合成乳，合成乳是由尿素、烹饪油、清洁剂、苛性钠、糖、盐和脱脂乳粉等 在水中混合而成，它不含有自然乳，没有牛乳所含有的重要营养成分；二是往牛乳中兑水， 为了增重再加入植脂末或假蛋白粉(如三聚氰胺）等来提高原料奶的比重及假蛋白、脂肪含 量；而我国奶源检测标准仍不完善，检测技术有限，并不能保障奶源质量和安全。为此，与此 有关的一系列奶源安全事故不断发生。继2004年阜阳"大头娃娃"之后，2008年"三鹿奶 粉掺假三聚氰胺事件"就是不法分子为了牟取暴利，向牛乳中掺假提高假"蛋白质"的含量， 通过现有行业标准的凯氏定氮法检测，这一掺假行为严重地影响人民的生活健康和国家声 誉。
[0003] 牛奶、奶粉等牛乳制品主要由蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质组成。蛋 白质的含量将直接决定牛乳制品的营养价值和质量，是决定乳品质量的核心指标，因此研 宄奶源中的蛋白成份检测成为食品领域的一个热门课题。牛乳中蛋白质含量为3. 0~3. 5%， 其中酪蛋白（Caseins，简称CNs)占总蛋白含量约80%;乳清蛋白（Whey Protein)占20%; 乳清蛋白主要包括：乳白蛋白（aLA)、|3-乳球蛋白（|3-lactoglobulin，|3LG)，还含有少量 的IgG、LF (乳铁蛋白）、LP (乳过氧化氢还原酶）、PP (蛋白脉）等。
[0004] 牛乳制品质量控制涉及多个方面，其中牛乳蛋白质的检测是牛乳制品是否合格的 重要标准。为使牛乳制品的蛋白质达标，造假分子在牛乳制品中掺入碱、水、豆浆等，更有甚 者，掺入三聚氰胺等"假蛋白"。继2004年阜阳"大头娃娃"之后，2008年9月发生的"三鹿 奶粉掺入三聚氰胺假蛋白坑害幼儿"全国性严重的食品安全事故波及全国上百家奶制品企 业，包括蒙牛、伊利等超大型名牌奶制品生产企业。
[0005] 随着奶源类似的问题不断出现，国内像蒙牛、伊利等超大型名牌奶制品生产企业 曾经采取过众多的积极措施。其中，主要是大量引进进口牛奶奶源质量检测设备如：瑞典 Perten仪器公司研制的鲜奶、奶粉成分快速分析仪，该仪器主要可完成粉状、液体状和糊膏 状样品的蛋白质、脂肪、固形物、乳糖等指标的测定，每个样品仅需10~20秒即可完成上述 所有指标的测定；美国F0SS-120牛奶全组分分析仪，我国大部分的正规大型乳品厂都在使 用此仪器。但实际上由于国外食品安全法规十分严格，国外奶源掺假极少发生，这些进口的 牛奶奶源质量全自动检测设备基本上是针对牛奶的物理性状而进行检测，根本没有考虑检 测各种掺假的可能。
[0006] 目前，国际上少数公司如福斯也针对发展中国家奶源掺假现象研制一种"原料奶 质量保证模块"，希望用于原料奶中不同掺假的鉴定，能检测掺杂的外源成分如植脂末、水 解蛋白、乳清粉、豆浆等；但其价格十分昂贵，维系成本很高，在我国难以在全行业推广(见 表1)。且对现有的各种掺入外源蛋白的检测都存在一定的局限性，很多只适合于在实验室 内使用，需要复杂的样品处理过程或需要借助于一些昂贵的药品、设备和仪器，还不能很好 的应用于实践当中，有些只能对特定的掺假物进行检测，其他的一些掺假物可能会对此检 测方法造成干扰和影响，有些需要时间过长，不利于现场和野外检测。
[0007] 表1、国外检测奶制品中可能掺假的质量控制方法
分析牛乳蛋白的方法有凝胶电泳，等电聚焦，反相高效液相，染料结合法，凯氏定氮法 等。常用的凯氏定氮法操作繁琐，费时费力，且在操作中会产生大量有害气体而污染工作环 境，影响操作人员健康，同时其通过检测氮元素含量来反映蛋白质含量的方法存在技术上 弊端，如添加其它含氮类化合物可导致检测的表面蛋白质指标提高。因此，开发新的牛乳蛋 白质含量防伪检测技术对确保牛乳制品的安全具有十分重要的意义。
[0008] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0009] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种定量检测牛乳0 _乳球蛋 白的双抗体夹心法，旨在解决现有检测方法存在的费时费力，掺入外源蛋白的检测存在局 限性的问题。
[0010] 本发明的技术方案如下： 一种定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，包括步骤： A、 以牛乳0 LG作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞； B、 通过杂交瘤细胞，制备单克隆抗体； C、 对单克隆抗体的表位进行鉴定，得到已知表位的单克隆抗体，选取两株不同表位的 单克隆抗体，将其中一株与生物素进行反应，得到一株标记生物素的抗体和一株未标记生 物素的抗体； D、 以未标记生物素的抗体作为包被抗体，标记生物素的抗体作为检测抗体进行抗体配 对，然后根据抗体配对数据和夹心法对牛乳0 _乳球蛋白进行定量检测。
[0011] 所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述步骤A具体包括： 4-6周龄BALB/c小鼠作为免疫动物，经免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与克隆，得到杂 交瘤细胞克隆株。
[0012] 所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法快，其中，通过有限稀释法对 杂交瘤细胞孔进行克隆。
[0013]所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述步骤B具体包括： 取BALB/c小鼠，腹腔内注射石蜡油，1~2周后注射杂交瘤细胞；7-9天后，收集腹水，离心，吸 取上清，然后对收集的上清进行抗体纯化，得到抗牛乳0 LG的单克隆抗体。
[0014]所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述步骤C还包括：对 单克隆抗体的纯度及免疫印迹、单克隆抗体的亚类、单克隆抗体的效价及单克隆抗体的交 叉性进行鉴定。
[0015]所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述单克隆抗体的效 价为：以间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价，同时以NS-1细胞融合细胞腹水作为阴 性对照，以P/N值> 2. 1单克隆抗体最大稀释度作为单克隆抗体的效价。
[0016]所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述步骤C中，所述表 位的鉴定通过合成多肽，然后将合成的多肽与单克隆抗体特异结合，采用ELISA和Immuno dot-blotting检测出单克隆抗体的表位。
[0017]所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述步骤D具体包括： 以未标记生物素的抗体作为包被抗体，标记生物素的抗体作为检测抗体进行抗体配对，配 对过程包括：包被抗体包被、洗板、封闭、孵育，洗板；0 LG和牛乳粗蛋白孵育，洗板；检测抗 体孵育，洗板；加入链酶亲和素-HRP，孵育，显色，终止。
[0018]所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述抗体配对后还包 括：利用ELASE间接法确定包被抗体最佳稀释倍数，利用ELASE间接法确定检测抗体的最佳 稀释倍数。
[0019]所述的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，其中，所述步骤D中，所述夹 心法对牛乳0 _乳球蛋白进行定量检测的过程包括：以最佳稀释倍数的未生物素标记的单 抗作为包被抗体，然后包被过夜，洗板，封闭，孵育，洗板；牛乳过敏原0 LG按比例梯度稀 释，加入PBS，反应，洗板；以最佳稀释倍数的生物素标记的单抗作为检测抗体，反应，洗板； 加入链酶亲和素-HRP反应，洗