:2000稀释)，37°C 孵育45 min，洗板。将链酶亲和素-HRP按1:2000稀释，每孔加100 yL，37°C孵育45 min， 加TMB 37°C避过显色10 min，加入质量浓度12. 5% H2S04 50 yL /孔终止反应，在波长450 nm处测定吸光值（OD值)。
[0049] (3)检测抗体浓度的确定 利用ELASE间接法确定检测抗体的最佳稀释倍数。取最佳包被抗体按其最佳稀释倍 数稀释，每孔100uL，4°C包被过夜，洗板。每孔加200 yL封闭液，37°C孵育2 h，倒出封闭 液，洗板。牛乳过敏原0 LG按系列浓度梯度加入孔中，阴性对照孔用PBS，每孔加100 y L， 37°C孵育2 h，洗板。以标记生物素的最佳检测抗体为一抗(浓度分别按1 :1000，1 :5000，1 : 10000，1 :20000稀释)，37°C孵育45 min，洗板。将链酶亲和素-HRP按1:2000稀释，每孔加 100yL，37°C孵育 45 min，加 TMB 37°C避过显色 10 min，加入质量浓度 12.5% H2S04 50 yL /孔终止反应，在波长450 nm处测定吸光值（0D值)。
[0050] (4)检测牛乳0 LG的双单抗夹心ELISA法 根据抗体配对数据，每孔以最佳稀释度的单抗作为包被抗体，4 °C包被过夜，洗板。每孔 加200 yL封闭液，37°C孵育2h，洗板。牛乳过敏原0LG按比例梯度稀释，阴性对照孔加 入PBS代替，每孔加100 yL，37°C反应45 min，洗板。生物素标记的检测抗体单抗按最佳 稀释度每孔加入1〇〇 uL，37°C反应1 h，洗板。将链酶亲和素-HRP按1:2000的比例稀释， 每孔加100 UL，37°C反应45 min，洗板。将链酶亲和素-HRP按1:2000稀释，每孔加100 yL，37°C孵育 45 min，加 TMB 37°C避过显色 10 min，加入质量浓度 12.5% H2S04 50 yL / 孔终止反应，在波长450 nm处测定吸光值（0D值)。以系列浓度的牛乳过敏原LG为X轴， 对应0D值为Y轴，建立标准曲线。
[0051] (5)检测牛乳0LG 根据标准曲线，对牛乳样品进行检测。
[0052] 本发明检测对象为牛乳中的0 _乳球蛋白，其含量为牛乳总蛋白的10%，通过检测 其含量可反映牛乳的总蛋白含量。我们以1H8作为包被抗体，标记生物素的1G5为检测抗 体作为配对抗体所建立的双抗体夹心法，0LG蛋白的检出限为1.6 ng*mL'标准曲线在 1.6 ng^mLtSO 范围内线性良好，目前国际上双抗体夹心法的检测牛乳过敏原检 出限一般是约为2.5 ng*mL'本研宄已基本达到国际的平均水平。
[0053] 综上所述，本发明提供的定量检测牛乳乳球蛋白的双抗体夹心法，基于抗原 抗体高度专一识别的原理，可避免加入其它蛋白掺假的可能，且通过本发明的双抗体夹心 法可实现定量、快速的检测出0LG的含量。本发明的双抗体夹心法灵敏度高，稳定性好，成 本低。
[0054] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。
【主权项】
1. 一种定量检测牛乳e-乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，包括步骤： A、 以牛乳0LG作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞； B、 通过杂交瘤细胞，制备单克隆抗体； C、 对单克隆抗体的表位进行鉴定，得到已知表位的单克隆抗体，选取两株不同表位的 单克隆抗体?，将其中一株与生物素进行反应，得到一株标记生物素的抗体和一株未标记生 物素的抗体； D、 以未标记生物素的抗体作为包被抗体，标记生物素的抗体作为检测抗体进行抗体配 对，然后根据抗体配对数据和夹心法对牛乳0 _乳球蛋白进行定量检测。2. 根据权利要求1所述的定量检测牛乳0 _乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，所 述步骤A具体包括：4-6周龄BALB/c小鼠作为免疫动物，经免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的 筛选与克隆，得到杂交瘤细胞克隆株。3. 根据权利要求2所述的定量检测牛乳0 -乳球蛋白的双抗体夹心法快，其特征在于， 通过有限稀释法对杂交瘤细胞孔进行克隆。4. 根据权利要求3所述的定量检测牛乳0 -乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，所 述步骤B具体包括：取BALB/c小鼠，腹腔内注射石蜡油，1~2周后注射杂交瘤细胞；7-9天 后，收集腹水，离心，吸取上清，然后对收集的上清进行抗体纯化，得到抗牛乳0LG的单克 隆抗体。5. 根据权利要求1所述的定量检测牛乳0 _乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，所 述步骤C还包括：对单克隆抗体的纯度及免疫印迹、单克隆抗体的亚类、单克隆抗体的效价 及单克隆抗体的交叉性进行鉴定。6. 根据权利要求5所述的定量检测牛乳0 -乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，所 述单克隆抗体的效价为：以间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价，同时以NS-I细胞融 合细胞腹水作为阴性对照，以P/N值> 2. 1单克隆抗体最大稀释度作为单克隆抗体的效价。7. 根据权利要求1所述的定量检测牛乳0 _乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，所 述步骤C中，所述表位的鉴定通过合成多肽，然后将合成的多肽与单克隆抗体特异结合，采 用ELISA和Immunodot-blotting检测出单克隆抗体的表位。8. 根据权利要求1所述的定量检测牛乳0 _乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，所 述步骤D具体包括：以未标记生物素的抗体作为包被抗体，标记生物素的抗体作为检测抗 体进行抗体配对，配对过程包括：包被抗体包被、洗板、封闭、孵育，洗板；0LG和牛乳粗蛋 白孵育，洗板；检测抗体孵育，洗板；加入链酶亲和素-HRP孵育，显色，终止。9. 根据权利要求8所述的定量检测牛乳0 -乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于，所 述抗体配对后还包括：利用ELASE间接法确定包被抗体最佳稀释倍数，利用ELASE间接法确 定检测抗体的最佳稀释倍数。10. 根据权利要求9所述的定量检测牛乳0 -乳球蛋白的双抗体夹心法，其特征在于， 所述步骤D中，所述夹心法对牛乳e-乳球蛋白进行定量检测的过程包括：以最佳稀释倍 数的未生物素标记的单抗作为包被抗体，然后包被过夜，洗板，封闭，孵育，洗板；牛乳过敏 原eLG按比例梯度稀释，加入PBS，反应，洗板；以最佳稀释倍数的生物素标记的单抗作为 检测抗体，反应，洗板；加入链酶亲和素-HRP反应，洗板；加入链酶亲和素-HRP孵育，显色， 终止，测定OD值；以系列浓度的牛乳过敏原0LG为X轴，对应OD值为Y轴，建立标准曲线； 根据标准曲线，得到牛乳过敏原eLG的含量。
【专利摘要】本发明公开一种定量检测牛乳β-乳球蛋白的双抗体夹心法，其包括步骤：免疫动物，获得杂交瘤细胞；通过杂交瘤细胞，制备单克隆抗体；对单克隆抗体的表位进行鉴定，得到已知表位的单克隆抗体，选取两株不同表位的单克隆抗体，将其中一株与生物素进行反应，得到一株标记生物素的抗体和一株未标记生物素的抗体；以未标记生物素的抗体作为包被抗体，标记生物素的抗体作为检测抗体进行抗体配对，然后根据抗体配对数据和夹心法对牛乳β-乳球蛋白进行定量检测。本发明基于抗原抗体高度专一识别的原理，避免加入其它蛋白掺假的可能，且本发明双抗体夹心法可实现高效、定量的检测出βLG的含量。本发明的双抗体夹心法灵敏度高，稳定性好，成本低。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/577
【公开号】CN104931710
【申请号】CN201510335775
【发明人】吴序栎, 何宗民, 刘志刚, 夏兵兵, 刘波
【申请人】深圳大学, 深圳市晨光乳业有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月17日