一种过敏原阳性血清的纯化制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种过敏原阳性血清的纯化制备方法。
【背景技术】
[0002] 过敏是一种机体的变态反应，是人对正常物质（过敏原）的一种不正常的反应，当 过敏原接触到过敏体质的人群才会发生过敏，过敏原有花粉、粉尘、异体蛋白、化学物质、紫 外线等几百种。在过敏反应的发生过程中，过敏介质起着直接的作用，过敏原是过敏病症 发生的外因，而机体免疫能力低下，大量自由基对服大细胞和嗜碱粒细胞的氧化破坏是过 敏发生的内因。一般来讲，当过敏原第一次进入机体时，与服大细胞或者是嗜碱性粒细胞 结合，产生白H帰，前列腺素等等的过敏因子，但并不会立即产生过敏，此特性有些将维持 2~3天，有的数月。当机体第二次接受该种过敏原时，服大细胞才会变形，产生过敏因子， 也就产生了一系列的过敏现象。
[0003] 过敏可W是体液（抗体）或者是细胞免疫机制介导的。在大多数情况下，可产生 过敏反应的抗体属于I班类，该些个体可W归类于患有I班介导的过敏反应。然而，并非所 有的特异反应性个体都会发生与I班相关的过敏反应；在非I班介导的过敏反应中，抗体也 可W属于IgG类，例如：包含右旋糖巧的免疫复合物导致的过敏性休克和和现在罕见的血 清病，它们W前被归于III型过敏反应。在患有过敏性支气管肺曲霉菌病（ABPA)病人中， I班和IgG抗体都可W被检出。接触性过敏性皮炎是W淋己细胞为介导的过敏性疾病的代 表。I班检测仍是公认的过敏检测的主流产品，由于点刺注册问题和体外检测技术的提高， 体外检测今后将是过敏检测主流趋势；但是目前I班检测学术进展迟缓，基本没有新的发 展，因此提高检测质量和降低检测成本是主要开发方向。
[0004] 但是，由于过敏诊断试剂的发展缓慢W及前期人们的重视度有限，除了部分过敏 原可W购买到商业血清，大部分过敏原的阳性血清还是很难查询到的，临床收集少量可行， 大量或者高浓度的血清基本不能收集到，甚至于很多项目很少有合适的阳性血清（如；牛 肉、羊肉）。
[000引如公布号为CN103018436A，公布日为2013-4-3的一种用家兔制备鸡传染性支气 管炎阳性血清的方法，其在经过免疫取血后，仅将血液分离出血清，对血清进行离也过滤就 得到阳性血清。但是，该阳性血清存在使用效果不好的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种使用效果优良的过敏原阳性血清的纯化 制备方法。
[0007] 为解决W上技术问题，本发明采取如下技术方案：
[0008] -种过敏原阳性血清的纯化制备方法，包括用过敏原对健康动物进行免疫、采血 后获得抗血清的步骤和对所述的抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤，所述的纯化的具体 方法为：
[0009] 对所述的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；将所述的IgG抗体和人I班化按质 量比为1:1~2偶联后，经分离纯化获得IgG-I班化连接物浓溶液，将所述的IgG-I班Fc 连接物浓溶液稀释至浓度为0. 5~1yg/ml，即得所述的阳性血清。
[0010] 优选地，采用琼脂糖亲和介质或者采用免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。
[0011] 进一步优选地，所述的琼脂糖亲和介质为Protein-Ase地arose化-4B。
[0012] 进一步优选地，所述的免疫亲和层析柱为所述的过敏原与琼脂糖凝胶连接成的亲 和层析柱。
[0013] 进一步优选地，所述的抗血清先经过硫酸馈处理后，再采用所述的免疫亲和层析 柱进行所述的亲和纯化。
[0014] 优选地，所述的人I班化是将人源I班溶解木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白 酶消化，再用楓己醜胺终止消化反应后，用琼脂糖亲和介质提取获得的。
[0015] 优选地，所述的IgG抗体和所述的人I班化通过2-亚胺四氨喔吩偶联剂或 4-(N-马来醜亚胺基甲基）环己焼-1-駿酸玻巧醜亚胺醋偶联剂活化后，在抑7. 2~7. 4 的条件下进行所述的偶联。
[0016] 进一步优选地，所述的2-亚胺四氨喔吩偶联剂的浓度为9~llmg/ml，所述的 4-(N-马来醜亚胺基甲基）环己焼-1-駿酸玻巧醜亚胺醋偶联剂的浓度为4~6mg/ml。
[0017] 优选地，采用Se地adex200凝胶纯化柱进行所述的分离纯化。
[001引优选地，采用含质量比为0.4~0.6%的牛血清白蛋白、抑7. 5~8. 5、0. 09~ 0.llmol/L的H轻甲基氨基甲焼缓冲液将所述的IgG-I班化连接物浓溶液进行所述的稀 释。
[0019] 由于W上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0020] 我们可W根据市场需要来有计划的生产（从几毫升到几千毫升），并且可W有效 的控制批间差异。该是目前流行的阳性血清的制备方法无法做到的。另外，我们用I班Fc 与抗血清中的IgG连接，相比于用I班与IgG连接的阳性血清的分子量小，该样就可W尽量 避免交叉反应的发生，提高特异性的同时，在阳性血清上有效的保留了二抗的结合位点。
[0021] 本发明方法可批量制备各种过敏原的阳性血清，解决了检测试剂盒制备过程中的 阳性质控问题，也可W作为校准品的生产原料，并且本制备方法简单易行。
【附图说明】
[0022] 附图1为兔抗柳树IgG-I班分离纯化图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于W下实施 例。实施例中采用的实施条件可W根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施 条件为本行业中的常规条件。
[0024] 实施例1
[00巧](一）过敏原的免疫和兔抗血清效价测定
[0026] 材料与仪器
[0027] 1、过敏原；过敏原冻干粉，过敏原为牛肉；
[0028] 2、佐剂；弗氏完全佐剂，购自sigma公司，货号（F5881);弗氏不完全佐剂，购自 sigma公司，货号（F5506);
[0029] 3、动物；选3只（每种过敏原免疫3只兔子）2月龄、体重1. 5~2. 0kg的健康新 西兰大白兔；
[0030] 4、二抗：HRP标记的羊抗兔IgG;
[0031] 5、耗材；H通器、一次性注射器、移液器等。
[00础免疫步骤
[0033] 1、免疫过敏原准备：用BCA蛋白质测定法来确定冻干粉溶解后过敏原的浓度，取 4mg过敏原，并用PBS将其稀释至600yL，用H通器将过敏原与完全佐剂或不完全佐剂（过 敏原V:佐剂V= 6:5)乳化，直至将一滴乳液滴入水中呈现球形而不分散则过敏原准备好。 首次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫均用弗氏不完全佐剂。
[0034] 2、动物免疫：将购买的3只新西兰大白兔在动物房养殖1周，使动物适应环境；将 制备好的乳液，用1ml注射器进行颈部或背部皮下免疫注射，每只新西兰大白兔注射3点， 每点注射300yL;免疫周期为14天。
[00巧]3、抗血清的制备：每只动物免疫前先于一侧耳缘静脉抽取2血血（作为空白对 照），之后每次免疫14天，下次免疫前进行耳缘静脉取血用于抗血清评价；取血后取下针 头，将注射器中的血缓缓转移至离也管中，于4C冰箱中过夜，取上清即为血清，析出淡黄色 抗血清；将抗血清转移至另一管中，血凝块W1500xg离也lOmin。吸出上清液合并收集到 的抗血清管中；抗血清分装保存于一7(TC。
[0036] 4、抗血清效价的测定；采用酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbent assay;ELISA)，用包被缓冲液将过敏原（牛肉）稀释至10yg/ml，除阴性孔外每孔加 100yL即1yg，4°C包被过夜；阴性对照1包被1yg羊肉过敏原，4°C包被过夜；阴性对照2 包被1yg花生过敏原，4°c包被过夜；空白对照1为动物免疫开始前的血清；空白对照2为 不含一抗抗体的一抗赔育封闭液；空白对照3为HRP标记的羊抗兔IgG赔育封闭液；其余孔 为按1:100、1:200倍比稀释的抗血清，进行效价测定。每次效价测定时平行进行上次收集 抗血清的效价测定，免疫前后抗血清效价相近时，则可W终止免疫杀兔取血，如果效价还有 明显提高则继续免疫。
[0037] W牛肉免疫兔后抗血清评价结果表1 :
[0038] 表 1
[0039]
[0040]
[0041] 注；A列数据为免疫6次后测定的抗血清效价；B列数据为免疫7次后测定的抗血 清效价
[0042] 从上述表格中可W看出兔免疫6次和7次后，抗血清效价基本趋于稳定，按照实验 设计评价的血清梯度为1:100-1:1600000,其中当血清稀释至1 ;51200时，0D值为空白孔 的2倍左右，判断为阳性有效价，但当再进行稀释时0D值基本等于空白值或不到空白对照 值的两倍，判断为无效价。A1-A2和B1-B2为阴性对照，从数值可W看出获取的兔抗血清与 其他过敏原没有反应性；A3-A5和B3-B5为空白对照，可W看出过敏原与免疫前的兔血清、 与二抗均不会产生非特异反应；其他孔的反应为牛肉过敏原和兔抗牛肉过敏原的特异性反 应。
[0043] (二）抗血清的亲和纯化
[0044] 材料与仪器
[004引 1、Protein-Ase地arose化-4B;蠕动粟；离也管；离也机；过滤器；玻璃柱；分光 光度