[0103] 4、洗脱缓冲溶液：将3. 75g甘氨酸巧OmM)溶解于1L蒸觸水中，用肥1调节抑 2. 6 ;
[0104]5、其他材料；0. 2M碳酸盐缓冲液（pH9.W、1.OmM肥1、1. 0M甘氨酸溶液、 CNBr-activedSe地arose4B-C1 (GE)、柱料储存液（0. 1MPBS，含 1%氨基己酸，pH7. 4)。
[0105] 操作步骤
[0106] 1、准备免疫亲和层析柱：将免疫使用的抗原与琼脂糖凝胶连接，做成亲和层析柱。 具体为：将特异性的过敏原用0.2M碳酸盐缓冲液（pH9.5)溶解稀释成1.0mg/ml。再用 1.OmM肥L处理活化好的Se地arose4B-C1 (CNBr-activedSepharose4B-C1),然后用 0. 2M碳酸盐缓冲液（pH9. 5)稀释成1.Og/ml。再将该两部分按1 ;1的比例进行混合，在 室温下反应16~20小时。然后离也，收集上清液。测上清液的蛋白浓度，再与最初投放的 过敏原的浓度和量进行比较，算出有多少抗原接在柱子上。剩下的Se地arose4B-Cl放入 1.0M甘氨酸溶液，溶液的量为Se地arose4B-Cl;1.0M甘氨酸溶液=1 ;1，反应4小时后。用 0. 1M的肥1，0. 1M化0H和2M尿素溶液分别W3倍柱体积依次进行清洗，最后用储存液保 存。
[0107] 2、在容器中将等体积的亲和层析柱与过硫酸馈处理后的动物血清充分混合，轻摇 2h。将混合物缓慢加入玻璃柱中，利用粟控制填充速度为Iml/min~2ml/min，避免柱干，利 用3~10倍于柱床体积缓冲溶液平衡柱子。
[0108] 3、用TBS缓冲溶液清洗柱子至吸收值A在280nm<0. 008后，再用高盐缓冲液洗 去非特异结合蛋白。加抑2. 6洗脱缓冲溶液，W〇.5ml/min的速度洗脱至吸收值A在 280皿<0. 008。用已经加入100yL中和缓冲溶液的1. 5mlEP管分管收集洗脱液，混匀后用 抑试纸检查洗脱液的抑，如果抑低于7可利用中和缓冲液调至约抑7. 4W防止抗体的变 性；
[0109] 利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于〇.5mg/ml可加入 10%的甘油W便保存，将纯化的IgG抗体分装后在2C~8C保存；
[0110] 用含0. 05 %叠氮化轴的TBS缓冲溶液清洗柱子后，将柱子储存在2 °C~8 °C环境。
[0111] (H)IgG抗体与人I班化偶联
[0112] 材料与仪器
[011引1、人I班Fc，由苏州浩欧博生物医药有限公司研制，W磯酸盐缓冲液保存的；
[0114] 2、木瓜蛋白酶消化液（Papain溶解液）；0. 1MTris，2mM邸TA(pH8. 0)。
[01 巧]3、Papain,购自Sigma公司；lodoacetamide,购自Sigma公司；Protein-A购自GE公司；
[0116] 4、偶联剂4-(N-马来醜亚胺基甲基）环己焼-1-駿酸玻巧醜亚胺醋（SMCC)，2-亚 胺四氨喔吩（2-IT)购自T肥RM0公司，H轻甲基氨基甲焼（TRI巧等化学试剂均达到化学 纯；
[0117] 5、G-25凝胶柱和Se地adex200凝胶纯化柱为GE公司产品。
[011引操作步骤
[0119] 1、人I班，纯度为95%，浓度为Img/ml，先用Papain消化液（也叫溶解液），抑= 8. 0透析，然后加入浓度为Papain;1班=100:1 (w/w)进行消化30min，再在消化液中加入 lodoacetamide终止反应，使用ProteinA将I班化部分纯化出来。
[0120] 2、取Img的IgG抗体溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液15yL，室温静置30min，用 G-25凝胶柱除游离SMCC，收集活化后抗体，4C保存备用；
[0121] 3、取1.5mg人I班化部分，加入lOmg/ml的偶联剂2-IT溶液3uL，室温静置 20min，加入0.Imol/L的甘氨酸溶液10yL，室温静置5min。用G-25凝胶柱除游离的2-IT， 收集活化后抗体，4C保存备用；
[0122] 4、将上述活化的IgG抗体与活化的人I班化部分混合，在抑7. 3的条件下静置 20h，用Se地adex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，4°C保存备用；
[0123] 5、将IgG-I班化连接物浓溶液用含0. 5%牛血清白蛋白、抑8.0、0.Imol/L的 TRIS缓冲液稀释到0. 5yg/ml，即得柳树过敏原的阳性血清。
[0124] (四）用化adia公司生产的特异性过敏原I班抗体检测盒对实施例1制备得到的 阳性血清进行测定，结果如表6 :
[01巧]表6
[0126]
[0127] 注；Phadia过敏原I班检测定级；<0. 35KU/L为阴性；0. 35-0. 69为1级阳性； 0. 7-3. 49为2级阳性；3. 5-17. 49为3级阳性；17. 5-49. 99为4级阳性；50-99. 99为5级 阳性；〉100KU/L为6级阳性。
[012引 从表6可见，3批次aDT140105、L0T140327、L0T140507)的阳性血清质控样本，用 化adia过敏原I班检测试剂盒测定为阳性样本，并且为5-6级阳性样本即强阳性。另外从 表格中可W看到，质控样本倍比稀释后，测定值也为倍比稀释的。综合说明我们的样本制备 成功，可W作为样本用于试剂盒的质控。
[0129] W上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人±能够了解本 发明的内容并加W实施，并不能W此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所 作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种过敏原阳性血清的纯化制备方法，包括用过敏原对健康动物进行免疫、采血后 获得抗血清的步骤和对所述的抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤，其特征在于：所述的 纯化的具体方法为： 对所述的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；将所述的IgG抗体和人IgE Fc按质量比 为1:1~2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgE Fc连接物浓溶液，将所述的IgG-IgE Fc连接 物浓溶液稀释至浓度为〇. 5~I y g/ml，即得所述的阳性血清。2. 根据权利要求1所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采用琼脂糖 亲和介质或者采用免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。3. 根据权利要求2所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的琼脂 糖亲和介质为 Protein-A sepharose CL-4B。4. 根据权利要求2所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的免疫 亲和层析柱为所述的过敏原与琼脂糖凝胶连接成的亲和层析柱。5. 根据权利要求2或4所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的 抗血清先经过硫酸铵处理后，再采用所述的免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。6. 根据权利要求1所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的人 IgE Fc是将人源IgE溶解木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白酶消化，再用碘乙酰胺终止 消化反应后，用琼脂糖亲和介质提取获得的。7. 根据权利要求1所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的IgG 抗体和所述的人IgE Fc通过2-亚胺四氢噻吩偶联剂或4-(N-马来酰亚胺基甲基）环己 烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂活化后，在PH 7. 2~7. 4的条件下进行所述的偶联。8. 根据权利要求7所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所述的2-亚 胺四氢噻吩偶联剂的浓度为9~11 mg/ml，所述的4-(N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧 酸琥珀酰亚胺酯偶联剂的浓度为4~6 mg/ml。9.根据权利要求1所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采用 Sephadex200凝胶纯化柱进行所述的分离纯化。10. 根据权利要求1所述的过敏原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采用含质 量比为0. 4~0. 6%的牛血清白蛋白、pH 7. 5~8. 5、0. 09~0. llmol/L的三羟甲基氨基甲 烷缓冲液将所述的IgG-IgE Fc连接物浓溶液进行所述的稀释。
【专利摘要】本发明涉及一种过敏原阳性血清的纯化制备方法，包括用过敏原对健康动物进行免疫、采血后获得的抗血清的步骤和对所述的抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤，所述的纯化的具体方法为：对所述的抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；将所述的IgG抗体和人IgEFc按质量比为1:1～2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgEFc连接物浓溶液，将所述的IgG-IgEFc连接物浓溶液稀释至浓度为0.5～1μg/ml，即得所述的阳性血清。本发明方法可批量制备各种过敏原的阳性血清及其他各种阳性血清的纯化制备，解决了检测试剂盒制备过程中的阳性质控问题，也可以作为校准品的生产原料，并且本制备方法简单易行。
【IPC分类】G01N33/531
【公开号】CN104977401
【申请号】CN201410553626
【发明人】王洪, 李庆春, 孙婵, 夏波, 秦枫, 钱林, 王秀伟
【申请人】苏州浩欧博生物医药有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年10月17日
【公告号】CN103926396A