一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检 测方法。
【背景技术】
[0002] 喹诺酮类（Quinolones，QNs)药物是一类抗菌作用强、抗菌谱广的人工合成抗菌 药，广泛应用于临床诊断、动物疾病预防及促生长。QNs在动物源食品中的过量或不当使 用会引起食用者产生潜在"三致"（致癌、致畸、致突变）作用，诱导致病菌产生耐药性，从而 威胁人类健。因此，许多国家和组织都限制其使用并制订出相应的最高残留限量(MRLs): 美国禁止在食用动物养殖中使用FQNs ;日本批准使用的QNs仅有恩诺沙星、二氟沙星、奥 比沙星、达氟沙星、马波沙星、氧氟沙星和恶喹酸。欧盟规定动物肌肉、肝脏和肾脏中达氟 沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、保沙星、沙拉沙星等的MRLs为 0.0 lmg-L 9mg，并在NO. 508/1999号法规中对牛奶中单诺沙星、氟甲喹、马波沙星、恩诺沙 星和环丙沙星的最高残留限量作了规定；世界食品法典委员会和世界各国对水产品中QNs 残留均有严格的限量要求，国际贸易中也对其限量有严格规定；我国于2002年规定了环丙 沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹等7种QNs药物在动物肌 肉组织中的最尚残留限量为10~500 μ g/kg。因此，对动物源食品中QNs残留量的检测尤 为重要。
[0003] 目前QNs的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC)、高效液相-串联质谱法 (HPLC-MS/MS)、酶联免疫法（ELISA)等。其中HPLC-MS/MS法灵敏度高、检测限低、测定种类 多、集高效分离和结构鉴定于一体，该仪器在我国检测机构中的配置也较为普遍，已成为复 杂混合物中痕量组分定性和定量的有力工具，已经制定了相关国家标准。检测包括样品前 处理和仪器分析两部分，而样品前处理技术严重落后于上机检测技术。样品前处理常用的 有液液萃取（LLE)和固相萃取（SPE) ;LLE是净化QNs的基本方法，但存在操作费时、消耗高 纯溶剂多以及样品易乳化等；SPE消耗溶剂少、不产生乳化现象，是净化QNs最常用的方法， 但目前市场上商品化的固相萃取柱一般只能一次性使用，价格较高，从而导致了高成本。另 外还有基质固相分散萃取、超临界流体萃取、固相微萃取、加速溶剂萃取和分子印迹固相萃 取等较新的方法也应用至QNs残留分析，但都处于研究阶段，技术尚不成熟。
[0004] 本申请的发明人致力于动物源食品中喹诺酮类残留检测的研究，发明专利申请 CN104316615A (膜透析-高效液相色谱串联质谱法测定动物源食品中7种喹诺酮残留的方 法）中采用膜透析处理样品，在5.0、10. 0、25.0 μ g/kg 3个浓度添加水平平均回收率在 65. 5%~84. 1%之间，变异系数在4. 3%~11. 6%之间，样品处理简单、灵敏度高，重现性好， 经济，可用于动物源食品中7喹诺酮类残留的检测确证。但是采用膜透析法处理样品耗时 长(透析时间彡6h)，不利于样品的快速检测。超滤（ultrafiltration，UF)主要为筛分机 理，通常为不对称结构，膜孔径的大小和膜表面的性质起着不同的截留作用。其过滤粒径介 于微滤和反渗透之间，约2~100nm，操作压力在0. 1~0. 5Mpa。其出现为动物性食品中农兽药 残留检测的前处理方法的改进提供了新的契机。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，采用超滤 法对样品进行前处理，仪器分析采用HPLC-MS/MS，可同时检测动物源性食品中恩诺沙星 (ENR)、环丙沙星（CIP)、恶喹酸（0X0)、沙拉沙星（SAR)、双氟沙星（DIF)、氟甲喹（FLU)、萘啶 酸（NDL)、氧氟沙星（0FL)、诺氟沙星（N0R)、丹诺沙星（DAN) 10种喹诺酮类药物。
[0006] 本发明的技术方案是：一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，其包括步 骤：将待测组织样品经预处理后，提取上清液加入超滤管中，超滤管放入离心机中离心，离 心出的液体取出用氮气吹干，流动相定容，供仪器测定分析。
[0007] 其中，所述预处理步骤为：准确称取5. 00 g粉碎好的样品，加入20 mLl%乙酸酸化 乙腈，混勾，超声20 min，加烘好后的无水硫酸钠5 g混勾，8000 r/min的速率离心5 min; 所述超滤管为50 mL，截留分子量为3kD ; 所述离心为低温离心，优选5000 r/min离心10min。
[0008] 本发明仪器测定分析采用HPLC-MS/MS，其液相色谱柱采用通用性，填料选自十八 烷基键合相硅胶，流动相为〇. 1%甲酸溶液A-乙腈B，通过调整流动相比例和梯度均能达到 满意的峰形和分离效果。采用Waters Xbridge C18, 3.5 μπι 2. 1X150 mm色谱柱时，流动 相：0. 1% 甲酸溶液 A-乙腈 B，流速：0. 2 mL /min，梯度洗脱：t= 0 min，80%A，20% B; t= I min,80%A, 20%B ； t=6min, 40%A, 60% B ；t=10 min, 20%A, 80% B ；t=14 min, 20%A, 80% B ; t=14. I min，80%A, 20% B ; t=20min, 80%A, 20% B ;质谱条件为：电喷雾电离源正离子扫 描（ESI+)，多反应监测模式（MRM);电喷雾电压：5.0 kV;离子源温度：500 °C，雾化气压 力（GSl): 70 psi ;辅助气流速（GS2): 55 psi，气帘气压力（CUR): 20psi ;碰撞室入口电 压（EP) : 10 V ;碰撞室出口电压（CXP): 10 V，监测分析物的离子对进行药物残留确证分 析。
[0009] 本发明采用50 mL，截留分子量3kD的超滤管，10种分子量在200-400间的喹诺酮 经1%乙酸酸化乙腈提取，在离心力作用下均可从超滤管中被快速"过滤"出来，而被截留的 大分子物质在离心时不会损坏超滤膜。该前处理方法可同时提取10种喹诺酮，应用本发明 的HPLC-MS/MS测定，平均回收率在71. 4%~85. 9%之间，变异系数在3. 9%~10. 7%之间， 具有较好的回收率、稳定性和重复性。另外，大分子杂质被截留，因此大大降低了基质效应。 该方法完全可以满足动物源性食品中10种喹诺酮的日常检测要求。
【附图说明】
[0010] 图1-图10为多反应监测的特征离子色谱图。
【具体实施方式】
[0011] 1.样品的前处理 准确称取5.00 g粉碎好的样品，加入20 mLl%乙酸酸化乙腈，混匀，超声20 min，加烘 好后的无水硫酸钠5 g混勾，8000 r/