用于鉴定细胞表面抗原的免疫结合剂的方法
【专利说明】用于鉴定细胞表面抗原的免疫结合剂的方法
[0001] 本申请是2010年2月22日提交的同名发明专利申请201080003451.0的分案申 请。
[0002] 【背景信息】
[0003] 免疫结合剂，包括抗体、其缀合物和衍生物，作为治疗剂和诊断剂在商业上是极其 重要的。用于抗体制备或筛选的常规方法通常利用可溶性抗原。然而，对于某些膜结合的 蛋白抗原，如果从膜上溶解抗原将改变抗原上的构象表位，从而导致抗体制备或筛选的失 败。此外，免疫印迹和亲和层析法中的一个主要问题是将选择具有对抗原的中等亲和力的 抗体。运允许包含许多交叉反应性或粘性抗体（stickyantibody),从而在连续筛选方法中 造成负担。虽然已将表达膜结合抗原的细胞直接用于抗体制备，但仍然缺乏能够检测和富 集高亲和力的抗细胞表面抗原的抗体的高效筛选方法。
[0004]【发明概述】
[0005] 本发明提供了用于鉴定能够特异性结合细胞表面抗原的免疫结合剂例如scFv抗 体的方法。本发明的方法通常包括将标记的表达抗原的细胞与标记的表达免疫结合剂的细 胞接触，然后使用细胞分选仪分离结合表达抗原的细胞的表达免疫结合剂的细胞。此类方 法对于快速且高效地鉴定抗存在于膜内在蛋白（integralmembraneprotein)例如GPCR 中的构象表位的免疫结合剂是特别有用的。本发明还提供了使用本发明的方法鉴定的分离 的免疫结合剂和编码免疫结合剂的核酸。
[0006] 在一个方面，本发明提供了用于鉴定特异性结合目的细胞表面抗原的免疫结合剂 的方法。该方法包括：提供多个可操作地连接第一可分选标记的表达免疫结合剂的细胞； 提供多个可操作地连接至第二可分选标记的表达抗原的细胞，其中目的抗原展示在表达 抗原的细胞的表面；将表达抗原的细胞与表达免疫结合剂的细胞接触；和使用细胞分选器 (例如，巧光激活细胞分选器）从多个表达免疫结合剂的细胞分离一个或多个可特异性结 合表达抗原的细胞的表达免疫结合剂的细胞，其中单个细胞复合物（例如，抗原与B细胞受 体之间形成的复合物）中第一和第二可分选标记的存在标示着表达免疫结合剂的细胞与 表达抗原的细胞的结合，从而鉴定了结合目的抗原的免疫结合剂。
[0007] 在一些实施方案中，克隆性地分离分离的表达免疫结合剂的细胞。在一些实施方 案中，将表达免疫结合剂的细胞经历克隆扩增（clonalexpansion)。在其他实施方案中，从 表达免疫结合剂的细胞分离编码免疫结合剂的核酸序列。用于分离编码免疫结合剂的核酸 序列的适当方法包PCR，例如单细胞PCR。可在克隆性分离细胞后和/或克隆扩增后分离编 码免疫结合剂的核酸序列。
[0008] 在一些实施方案中，将使用本发明的方法分离的表达免疫结合剂的细胞经历基于 细胞的测定W在功能上表征免疫结合剂。适当的基于细胞的测定包括CELISA。
[0009] 在一些实施方案中，免疫结合剂是抗体。此类抗体包括小鼠抗体、兔子抗体、兔源 化（rabbitized)抗体、鸡抗体、骆驼抗体、骆驼源化（camelized)抗体、人抗体、人源化抗体 和嵌合抗体。适当的抗体形式包括但不限于F油、D油、纳米抗体（Nanobody)和scFv。
[0010] 在一些实施方案中，从外源基因表达目的抗原。在其他实施方案中，目的抗原是经 遗传工程改造的抗原。在其他实施方案中，目的抗原是膜内在蛋白。适当的膜内在蛋白包 括但不限于GPCR(例如，CXCR2)或离子通道。
[0011] 在一些实施方案中，第一或第二可分选标记是巧光标记。适当的巧光标记包括但 不限于巧光蛋白质、抗体/巧光缀合物（fluorconjugate)和巧光细胞标记。
[0012] 在一些实施方案中，表达抗原的细胞是酵母或哺乳动物细胞（例如，人细胞）。在 一些实施方案中，表达抗原的细胞表达外源抗原。在一些实施方案中，用表达载体转染表达 抗原的细胞。
[0013] 在一些实施方案中，表达免疫结合剂的细胞是酵母或哺乳动物细胞。适当的哺乳 动物细胞包括但不限于B细胞，例如兔B细胞。在一些实施方案中，从经免疫的动物例如通 过DNA接种免疫的动物分离B细胞。在一些实施方案中，表达免疫结合剂的细胞包含从表 达载体表达的免疫结合剂。
[0014] 在另一个方面中，本发明提供了编码通过本发明的方法鉴定的免疫结合剂的分离 的核酸分子。
[0015] 在另一个方面中，本发明提供了产生能够结合目的抗原的免疫结合剂的方法，其 包括将通过本发明的方法鉴定的编码免疫结合剂的核酸序列引入表达环境W便产生编码 的免疫结合剂。
[0016] 在另一个方面中，本发明提供了由本发明的方法产生的免疫结合剂。
[0017] 在另一个方面中，本发明还提供了用于鉴定特异性结合目的细胞表面抗原的B细 胞克隆的方法，其包括：用编码细胞表面抗原的DNA免疫动物；从免疫的动物分离B细胞； 用第一可分选标记标记B细胞；提供多个可操作地连接至第二可分选标记的表达抗原的细 胞，其中目的抗原展示在表达抗原的细胞的表面；将表达抗原的细胞与B细胞接触；和使用 细胞分选器从多个B细胞分离可特异性结合表达抗原的细胞的一个或多个B细胞，其中第 一和第二可分选标记在单个细胞复合物中的存在标示着B细胞与表达抗原的细胞结合，从 而鉴定了结合目的抗原的B细胞克隆。
[0018]【附图概述】
[0019] 图1示意性显示用巧光抗体2标记的B细胞1与用细胞内染料3染色的表达祀的 细胞相互作用。（4:选择的祀/抗原；5:B细胞受体度CR))。
[0020] 图2:结合ESBA903可溶性祀的兔B细胞的FACS选择过程。图2A:按照前向和侧 向散射口控淋己细胞。图2B:在它们当中，选择IgG+IgM-细胞（可能是记忆B细胞）（加 圈显示的）。图2C:用ESBA903-阳和ESBA903-PerCP双染色的细胞（加圈显示的）预期编 码针对ESBA903的高亲和力IgG。在96孔板中分选显示最亮巧光的细胞（未加圈的）。
[0021] 图3:用抗TNFa抗体（阳标记的）包被的珠粒结合TNFa-转染的C册细胞（上 图框）。用抗CD19抗体（APC标记的）包被的对照珠粒不结合TNFa转染的CH0细胞（中 图框）。用抗TNFa抗体（PE标记的）包被的珠粒不结合野生型（wt)C册细胞（下图框）。 左边的散点图值otplot)显示前向和侧向散射，其分别表示事件的大小和粒度。单珠粒 (约3um)群体在P2被口控。最终结合珠粒的C册细胞（约30um)在P1被口控。中间的散 点图显示就其阳或APC染色而言的P1事件（C册细胞）。因此，与抗TNFa珠粒相互作用 的细胞将出现在P3 口控中，与抗CD19珠粒相互作用的细胞将出现在P4 口控中。在右边， 描述了每一个样品的统计数据。
[002引图4:将用抗TNFa-PE包被的珠粒和用抗CD19-APC包被的珠粒与TNFa-转染的C册细胞混合在一起。C册细胞被口控（P1)，并且在它们当中，结合抗TNFaPE包被的珠粒 或抗CD19-APC包被的珠粒的细胞分别示于口控P3和P4中。未结合的珠粒可见于口控P2 中。
[0023] 图5a: 3种不同的CH0-TNFa-记忆B细胞悬浮液的FACS分析。左上：显示细胞悬 浮液前向和侧向散射的散点图。活细胞，包括一大群转基因CH0细胞和一小群记忆B细胞， 被口控。左下：显示APC和FITC巧光的散点图。此处，记忆B细胞（IgG+/IgM-)被口控。 运两个散点图对于全部3种样品都是相同的；因此，它们只显示一次。
[0024] 图f5b: 3个样品的直方图和群体分层（populationhierarchy):上：CH0-TNFa细 胞+ESBA105+ESBA105免疫的兔子的记忆B细胞；中：CHO-TNFa细胞+ESBA105+未免疫的 兔子的记忆B细胞；下：CHO-TNFa细胞+ESBA105免疫的兔子的记忆B细胞。在直方图上， 结合CH0细胞的记忆B细胞被口控。
[002引图6:由与用ESBA105 "包被的"TNFa转基因C册细胞混合的经免疫的淋己细胞 组成的悬浮液的FACS分析。图6a:显示细胞悬浮液前向和侧向散射的散点图。活细胞，包 括一大群转基因CH0细胞和一小群淋己细胞，被口控。图化：显示APC和FITC巧光的散点 图。此处，记忆B细胞（IgG+/IgM-)被口控。图6c:显示被口控的记忆B细胞的巧黄绿素 巧光的直方图。分选被口控的群体（结合CH0-TNFa-ESBA105复合物的记忆B细胞）。
[0026] 图7:用抗TNFaIgG包被的与CH0-TNFa度220)转基因细胞相互作用的珠粒的亮 视野显微镜检查图。
[0027] 图8:结合至B细胞的CH0-TNFa/ESBA105细胞（大细胞）的亮视野显微镜检查图 (左栏）和巧光显微镜检查图（右栏），所述B细胞（较小的细胞）在表面上具有抗ESBA105 抗体。
[002引【详述】
[0029] 本发明提供了用于鉴定能够特异性结合细胞表面抗原的免疫结合剂例如scFv抗 体的方法。本发明的方法通常包括将标记的表达抗原的细胞与标记的表达免疫结合剂的细 胞接触，然后使用细胞分选器分离结合表达抗原的细胞的表达免疫结合剂的细胞。此类方 法对于快速且高效地鉴定针对存在于膜内在蛋白例如GPCR中的构象表位的免疫结合剂是 特别有用的。本发明还提供了使用本发明的方法鉴定的分离的免疫结合剂和编码免疫结合 剂的核酸。
[0030] 在一个方面，本发明提供了用于鉴定特异性结合目的细胞表面抗原的免疫结合剂 的方法。该方法包括：提供多个可操作地连接至第一可分选标记的表达免疫结合剂的细胞； 提供多个可操作地连接至第二可分选标记的表达抗原的细胞，其中目的抗原展示在表达抗 原的细胞的表面上；将表达抗原的细胞与表达免疫结合剂的细胞接触；和使用细胞分选器 (例如，巧光激活细胞分选器）从多个表达免疫结合剂的细胞分离一个或多个可特异性结 合表达抗原的细胞的表达免疫结合剂的细胞，其中第一和第二可分选标记在单个细胞复合 物（例如，抗原与B细胞受体之间形成的复合物）中的存在标示着表达免疫结合剂的细胞 与表达抗原的细胞的结合，从而鉴定了结合目的抗原的免疫结合剂。
[0031] 在一些实施方案中，克隆性分离所述分离的表达免疫结合剂的细胞。
[0032]在某些实施方案中，使用本领域技术人员公知的方法将克隆性分离的表达免疫结 合剂的细胞经历克隆扩增。
[0033] 在其他实施方案中，从表达免疫结合剂的细胞分离编码免疫结合剂的核酸序列。 可在克隆性分离后或在克隆扩增后进行核酸序列的分离。用于分离编码免疫结合剂的核酸 序列的适当方法包括PCR，例如单细胞PCR。
[0034] 在一些实施方案中，将使用本发明的方法分离的表达免疫结合剂的细胞经历基于 细胞的测定，W功能性表征免疫结合剂。适当的基于细胞的测定包括CELISA。
[0035] 在一些实施方案中，免疫结合剂是抗体。此类抗体包括小鼠抗体、兔子抗体、兔源 化（rabbitized)抗体、鸡抗体、骆驼抗体、骆驼源化（camelized)抗体、人抗体、人源化抗体 和嵌合抗体。适当的抗体形式包括但不限于F油、D油、纳米抗体（Nanobody)和scFv。
[0036] 在一些实施方案中，从外源基因表达目的抗原。在其他实施方案中，目的抗原是经 遗传工程改造的抗原。在其他实施方案中，目的抗原是膜内在蛋白。适当的膜内在蛋白包 括但不限于G蛋白偶联受体（GPCR，例如CXCR2)或离子通道。
[0037] 在一些实施方案中，第一或第二可分选的标记是巧光标记。适当的巧光标记包括 但不限于巧光蛋白质、抗体/巧光缀合物和巧光细胞标记。
[003引在一些实施方案中，表达抗原的细胞是酵母或哺乳动物细胞（例如，人细胞）。在 一些实施方案中，表达抗原的细胞表达外源抗原。在一些实施方案中，用表达载体转染表达 抗原的细胞。
[0039] 在一些实施方案中，表达免疫结合剂的细胞是酵母或哺乳动物细胞。适当的哺乳 动物细胞包括但不限于B细胞，例如兔B细胞。在一些实施方案中，从经免疫的动物，例如 利用DNA接种免疫的动物分离B细胞。在一些实施方案中，表达免疫结合剂的细胞包含从 表达载体表达的免疫结合剂。
[0040] 在另一个方面中，本发明提供了编码通过本发明的方法鉴定的免疫结合剂的分离 的核酸分子。
[0041] 在另一个方面中，本发明提供了产生能够结合目的抗原的免疫结合剂的方法，包 括将通过本发明的方法鉴定的编码免疫结合剂的核酸序列引入表达环境W便产生编码的 免疫结合剂。
[0042] 在另一个方面中，本发明提供了通过本发明的方法产生的免疫结合剂。
[0043] 在另一个方面中，本发明还提供了用于鉴定特异性结合目的细胞表面抗原的B细 胞克隆的方法，其包括：用编码细胞表面抗原的DNA免疫动物；从经免疫的动物分离B细 胞；用第一可分选标记标记B细胞；提供多个可操作地连接至第二可分选标记的表达抗原 的细胞，其中目的抗原展示在表达抗原的细胞的表面上；将表达抗原的细胞与B细胞接触； W及使用细胞分选器从多个B细胞分离可特异性结合表达抗原的细胞的一个或多个B细 胞，其中第一和第二可分选标记在单细胞复合物中的存在标示着B细胞与表达抗原的细胞 结合，从而鉴定了结合目的抗原的B细胞克隆。
[0044]【定义】
[0045] 为了可更容易地理解本发明，如下定义某些术语。其他定义示于整个详细的说明 书中。
[0046] 术语"抗体"是指完整抗体和其任意抗原结合片段（即，"抗原结合部分"、"抗原 结合多肤"或"免疫结合剂"）或单链。"抗体"是指包含通过二硫键互连的至少两个重（H) 链和两个轻（L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每一个重链包含重链可变区（在本文中缩 写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域，CH1、C肥和C册。每一个轻链包含 轻链可变区（在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和 VL区还可细分成高变区（称为互补决定区（CDR))，其间散布有较保守的区域（称为构架 区（FR))。每一个VH和化包含3个CDR和4个FR，其W下列顺序从氨基端至簇基端排列： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结 构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子（包括免疫系统的各种细胞（例 如，效应细胞）和经典补体系统的第一成分（Clq))结合。
[0047] 术语"嵌合抗体"是指运样的抗体分子，其中（a)恒定区或其部分被改变、替换或 交换W便将抗原结合部位（可变区）连接至具有不同的或改变的种类、效应子功能和/或