用于鉴定细胞表面抗原的免疫结合剂的方法_3

文档序号:9395618阅读:来源:国知局
达抗原的细胞,其中,所述结合由表达抗原的细胞的表面上的抗原介导。在一些实施方案 中,表达抗原的细胞与表达免疫结合剂的细胞的结合由表达抗原的细胞表面上的抗原与表 达免疫结合剂的细胞表面上的免疫结合剂之间的直接相互作用组成。
[0071] 术语"克隆性分离"是指用于从细胞群体分离单个细胞克隆的任何方法。适当的 方法包括但不限于,细胞至多孔板的有限稀释和转移,W便每一个孔包含不超过单个细胞。
[0072] 术语"获得编码免疫结合剂的核酸序列"是指用于获得由表达免疫结合剂的细胞 表达的免疫结合剂的核酸序列的任何方法。适当的方法包括但不限于,来自表达免疫结合 剂的细胞的编码免疫结合剂的核酸序列的核酸分离、PCR扩增和DNA测序。在一些实施方 案中,通过PCR从单个细胞扩增编码免疫结合剂的核酸序列,即"单细胞PCR"。
[0073] 术语"外源抗原"是指通常不在特定宿主细胞中表达的抗原。例如,与宿主细胞相 比,外源抗原可来自不同的界、n、纲、目、属或种,例如在酵母细胞中表达的人抗原。此外或 可选地,外源抗原可来自相同种但不适当地在该宿主细胞中表达,例如在脑细胞中表达的 肺特异性抗原。"外源抗原"还指通常在正常细胞中未发现的突变抗原,例如在肺细胞中表 达的癌特异性突变抗原。
[0074] 术语"经遗传工程改造的抗原"是指通过重组DNA技术产生的任意抗原,包括为嵌 合体或包含点突变、缺失和/或插入的抗原。除非另外定义,否则本文中使用的全部技术和 科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中 描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明,但在下文中描述适 当的方法和材料。在矛盾的情况下,W本说明书(包括定义)为准。此外,材料、方法和实 施例仅是举例说明性的并且无意是限定性的。
[00巧]在下列部分更详细地描述本发明的不同方面。应理解,可随意组合不同实施方案、 参数选择和范围。此外,取决于具体的实施方案,可不使用选择的定义、实施方案或范围。
[0076] 本发明提供了使用FACS鉴定和分离与表达相应抗原的细胞粘附的表达免疫结合 剂的细胞的筛选方法。在具体的实施方案中,免疫结合剂是抗体。
[0077] 【抗原表达】
[0078] 用于抗体制备的祀抗原可W是任何蛋白质、肤、核巧酸、碳水化合物、脂质和可溶 性的或在细胞表面上表达的或整合在质膜中的其他分子。抗原可W是天然的或合成的。优 选,祀抗原是蛋白质或肤。祀抗原的非限定性实例包括CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、 CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-l、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、 CIC-肺、Bestro地ins、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAVI. 1、NAVI. 2、 NAVI. 3、NAVI. 4、NAVI. 5、NAVI. 6、NAVI. 7、NAVI. 8、NAVI. 9、1-憐酸銷氨醇受体(SIPIR)、 NMDA通道等。在一个实施方案中,祀抗原是跨膜蛋白。在另一个实施方案中,祀抗原是多次 跨膜蛋白,例如,G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道等。
[0079]GPCR家族具有至少 250 个成员(Strader等人FA沈BJ.,9:745-754, 1995 ; Strader等人Annu.Rev.Biochem. , 63:101-32, 1994)。已估计百分之一的人基因可编 码GPCR。GPCR结合范围广泛的配体,包括光子、小生物胺类(即,肾上腺素和组胺)、 肤(即,比-8)和大的糖蛋白激素(即,甲状旁腺素)。当配体结合时,GPCR通过激活 鸟嚷岭核巧酸结合蛋白(G蛋白)调控细胞内信号转导途径。有趣地,GPCR在人巨细 胞病毒和瘤疹病毒中具有功能性同源物化omologue),运提示可能已在病毒发病机制 的进化过程中获得GPCR(Strader等人,FA沈BJ.,9:745-754, 1995;Arvanitakis等人 化 1:ure, 385:347-350, 1997 ;Mu巧hy,Annu.Rev.Immunol. 12:593-633, 1994)。
[0080] 迄今已知的大多数GPCR的特征性质是,7簇疏水性氨基酸残基位于一级结构中并 且在其每一个区域通过(横跨)细胞膜。所述结构域据认为代表通过3个细胞内环、3个 细胞外环W及氨基和簇基末端结构域连接的跨膜a-螺旋化化Iczewski等人,Science 289, 739-45(2000))。大多数GPCR在前两个细胞外环的每一个中具有单个保守半脫氨 酸残基,其形成据认为稳定功能性蛋白质结构的二硫键。7个跨膜区被命名为TM1、TM2、 TM3、TM4、TM5、TM6和TM7。众所周知,上述运些结构在G蛋白偶联受体蛋白中是很普遍的 并且相应于其中蛋白质通过膜的区域(穿膜区(membrane-spanningregion)或跨膜区 (transmembraneregion))的氨基酸序列W及穿膜区附近的氨基酸序列在受体当中通常是 高度保守的。因此,由于GPCR中高度的同源性,新型GPCR的鉴定W及此类新型成员的细胞 内和细胞外部分的鉴定可由本领域技术人员容易地完成。例如,Watson和Arkinstall的 书(1994)(通过引用合并入本文)提供了 50多种GPCR的序列。该书还描述了每一个序列 的包含各个跨膜结构域的精确残基。
[0081]G蛋白偶联受体的小配体结合位置据认为包含位于细胞外表面附近并且由若干G 蛋白偶联受体跨膜结构域形成的亲水性小窝化y化ophilicsocket),该小窝被G蛋白偶联 受体的疏水性残基包围。每一个G蛋白偶联受体跨膜螺旋的亲水侧据假设面向内部,形成 极性配体结合位置。已暗示TM3在若干G蛋白偶联受体中具有配体结合位置,例如包括TM3 天冬氨酸残基。此外,TM5丝氨酸、TM6天冬酷胺和TM6或TM7苯丙氨酸或酪氨酸也牵设配 体结合。肤激素受体和具有其他更大的配体的受体例如糖蛋白(LH、FSH、hCG、TSH)和Ca27 谷氨酸/GABA类受体的配体结合位置可能位于细胞外结构域和环中。
[0082] 从无活性受体转换至活性受体的关键事件是具有7个跨膜螺旋的GPCR的 跨膜螺旋3灯M3)和6灯M6)的配体诱导的构象改变化Gether和B.K.Ko化nka,J. Biol.化em. 273, 17979-17982 (1998))。此类螺旋运动又改变受体的细胞内环的构 象W促进缔合的异S聚体G蛋白的激活。诱变研究仅Cotecchia,J.Ostrowski,M. A.Kjelsberg,M.G.Caron和R.J.Lefkowitz,J.Biol.畑em. 267, 1633-1639(1992); E.Kostenis,B.R.Conklin和J.Wess,Biochemistry36,1487-1495 (1997);M.A.Kjelsberg,S.Coteechia,J.Ostrowski,M.G.Caron,和R.J.Lefkowitz,J.Biol. 化em. 267,1430-1433(1992))证明第S细胞内环(i3)介导大部分受体与G蛋白之间的 偶联。也已显示表达为微基因(minigene)的13环直接与肾上腺素能受体竞争对Gq的 结合(L.M.Luttrell,J.Ostrowski,S.Cotecchia,H.Kendal和R.J.Lefkowitz,Science 259,1453-1457(1993))或可在无细胞条件下作为可溶性肤激活G蛋白化Okamoto等 人,Cell67,723-730(1991))。
[0083] 目的抗原可W是祀细胞(有时也称为表达抗原的细胞)中的内源性来源的抗原。 可选地,可将外源分子引入细胞W表达抗原。可通过本领域技术人员已知的任何方法实现 抗原至细胞内的引入。在一个实施方案中,可在体外将编码抗原为多肤的多核巧酸插入载 体,该载体可进一步引入用于表达的祀细胞。多核巧酸可包含祀抗原的cDNA序列、DM序 列或本领域内已知的其他序列。载体可W是质粒、粘粒、脂质体或本领域内已知的其他天 然或人造载体。引入可W是下列方法:转染、转化、感染、材料的直接显微注射、基因枪递送 化iolisticparticledelivery)、电穿孔或本领域内已知的其他方法。表达抗原的祀细胞 可W是本领域内已知的任意细胞,包括例如,直接获自动物的细胞,例如癌细胞、非癌细胞、 原代细胞等,或经分子改造的细胞,例如培养细胞(例如,中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、肥K293 细胞等)、永生化细胞、转染的/感染的细胞、T细胞等。可选地,祀细胞可来自非动物来源, 例如细菌、昆虫等。在一个实施方案中,表达祀抗原的细胞是酵母细胞,优选酵母球芽。可 选地,祀"细胞"可W是人造细胞样小体或结构,例如脂质体、单层膜小体等。祀细胞或细 胞样小体中抗原的表达可W是瞬时的,即,表达将在比较短的时间段(例如,从数分钟至数 天)后减弱或终止,或是稳定的,即,表达将W相对稳定的水平持续相对长的时间(例如,在 数天或细胞的数代后)。在一个优选实施方案中,抗体在祀细胞的质膜的细胞外表面上表 达。在另一个优选实施方案中,抗原是膜内在抗原或多次跨膜抗原。为了到达其在质膜上 的位置,可将抗原直接表达在运些位置上,或可在它们在祀细胞的细胞质中表达后将其迁 移至运些位置。该迁移可W是祀细胞的自然过程或是通过例如在抗原表达之前或之后连 接信号/标签分子(例如,高尔基分选信号,针对某些膜结合分子的抗体等)、错定移植物 (anchoringgraft)(例如,糖基化憐脂酷肌醇(GPI)错)或与抗原化学交联、突变抗原或本 领域内已知的导致其迁移的其他方法进行的工程改造过程。
[0084]【表达免疫结合剂的细胞和免疫】
[0085]在一个实施方案中,待通过本文中描述的方法选择的表达免疫结合剂的细胞是哺 乳动物B细胞,优选兔B细胞。
[0086]在优选实施方案中,B细胞源于用目的祀免疫的动物。可利用本领域技术人员已 知的任何方法实施动物的免疫。通常,从免疫的动物的淋己器官(例如脾或淋己结)分离 B细胞。
[0087]在一个优选实施方案中,通过DNA免疫/接种进行目的抗原的免疫。可选地,将表 达祀抗原的细胞注射入动物(例如,兔子、大鼠、小鼠、仓鼠、绵羊、山羊、鸡等)W进行免疫。 用于该免疫步骤的优选动物是兔子。DNA免疫/接种诱导快速免疫应答并且允许祀抗原天 然表达,并且通常仅天然表达。因为其不牵设重组蛋白的表达或操作,因此该方法比使用重 组蛋白的常规免疫更高效和更具成本效益。此外,更重要地,体内表达的抗原具有与天然背 景中的祀蛋白相同的二级结构和甚至可具有与其相同的翻译后修饰,运提高了制备的抗祀 抗原的抗体的识别正确性。示例性DNA免疫在加拿大专利申请CA2350078和W004/087216 中得到举例说明。具体地,通过基因枪法将编码作为祀抗原的多肤的DNA直接引入动物,从 而导致多肤在动物中表达,该表达引起抗所述多肤的抗体形成。为了获得更强的抗体形成, 同时应用所谓的基因佐剂(geneticadjuvant)和编码多肤的DNA。此类基因佐剂是表达 细胞因子(例如,GM-CSFJL-4和IL-10)和在实验室动物中刺激体液免疫应答的质粒。在 一个优选实施方案中,针对祀抗原的抗体在B细胞的细胞表面上表达为B细胞受体度CR)。 在另一个优选实施方案中,表达抗体的细胞是记忆B细胞,其特征在于在其表面上不存在 任何IgM并且因此可与常规B细胞区分。
[0088]在一个实施方案中,表达免疫结合剂的细胞是酵母细胞,并且免疫结合剂优选是 抗体片段,更优选scFv。
[0089] 【使用巧光激活细胞分选(FAC巧的筛选】
[0090] 在免疫步骤后,需要将B细胞上特异性结合祀抗原的膜结合抗体与表达非特异性 抗体的其他细胞分离。在一个优选实施方案中,通过抗原-抗体结合,在其质膜上表达特异 性抗体的B细胞粘附至表达抗原的祀细胞。在另一个优选实施方案中,在B细胞与祀细胞 之间可发生其他或更多相互作用(例如,相同或不同的抗原-抗体相互作用、化学交联、配 体-受体相互作用等)。B细胞可存在于表达不同抗体的B细胞的库中,或与其他免疫细胞 组合,直接从免疫的动物,从免疫的/未免疫的动物的库或从体外工程方法例如通过V值)J 基因重组技术产生的表达不同抗体的B细胞的文库收集。
[0091] 可在本领域内已知的任意方法中进行表达特异于祀抗原的抗体的B细胞的分离。 此类方法包括但不限于对抗原的淘选、有限稀释、亲和纯化或利用表达的抗体或产生抗体 的B细胞的特征的其他方法。
[0092] 在一个优选实施方案中,用标签标记表达抗原的细胞,所述标签用于将来检测和/ 或分离粘附的B细胞。标签可W是交联剂、抗原/抗体、小分子(例如,谷脫甘肤(GSH)、生 物素/抗生物素蛋白等)、磁性颗粒、巧光标签等。在一个优选实施方案中,用巧光蛋白/肤 标记表达抗原的细胞。在另一个实施方案中,还用标签优选不同的巧光蛋白/肤标记产生 抗体的B细胞。在另一个实施方案中,可通过B细胞上标记的巧光蛋白/肤的巧光发射检测 粘附至表达抗原的细胞的B细胞。在另一个实施方案中,利用其上标记的两种不同巧光蛋 白/肤的巧光发射检测处于粘附中的B细胞和表达抗原的细胞。在一个优选实施方案中, 可通过其上和粘附的APC上标记的巧光蛋白/肤的巧光发射来检测表达特异于祀抗原的抗 体的B细胞和进一步将其与产生其他抗体的B细胞分离。优选,该检测和分离可利用巧光 激活细胞分选(FAC巧技术来进行。
[0093] 首字母简略词FACS已被BectonDickinson(RranklinLakes,NJ)注册商标和拥 有。如本文中所使用的,术语FACS可代表任意形式的基于流式细胞术的细胞分选。
[0094] 巧光激活细胞分选是专业化类型的流式细胞术。其提供了基于每一个细胞的特定 光散射和巧光特征每次一个细胞地将生物细胞的异质混合物分选至2或更多个容器中的 方法。其是有用的科学仪器,因为其提供了来自个体细胞的巧光信号的快速、客观和定量记 录W及特别关注的细胞的物理分离。
[009引在经典的FACS系统中,细胞悬浮物在狭窄、快速流动的液流中央被带动。安排流 动W便细胞间存在大的间隔(与其直径相比)。振动机制引起细胞流中断成单独的微滴。 调整系统W便使超过1个细胞存在于一个微滴的概率较低。在液流即将断裂成微滴前,液 流通过其中测量每一个细胞的目的巧光特征的巧光测量站。将带电环置于正好液流断裂成 微滴的点上。基于刚才的巧光强度测量值将电荷置于环上,当微滴从流中断裂时相反电荷 被捕获在微滴上。然后带电荷的微滴下落通过静电偏转系统,该系统基于微滴的电荷使微 滴偏转进入容器。在一些系统中,将电荷直接用于液流并且断开的微滴保
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