一种兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的制备方法及其免疫分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于大分子蛋白免疫技术领域；特别设及用卵转铁蛋白免疫动物、特异性 抗体的制备及免疫分析方法的建立。
【背景技术】
[0002] 卵转铁蛋白（Ovotransferrin，0VTorGald3)是鸡蛋过敏原的主要过敏原之 一，其含量约占蛋清总蛋白的12%，它是一种有铁离子相结合的糖蛋白，卵转铁蛋白在自由 的形态下通常具有抗菌活性，卵转铁蛋白由两个结构域组成，分别为N域和C域，它是一条 单一肤链，由686个氨基酸组成，它能够与铁离子相结合，是一种糖蛋白，每个蛋白分子中 含有15个二硫键，具有抗氧化特性，目前对卵转铁蛋白的过敏性研究相对较少，卵转铁蛋 白对溫度的变化较为敏感，高溫可使其过敏性受到严重的影响。若与铁离子，锋离子等金属 结合形成复合体后就可W提高其热稳定性。
[0003] 卵转铁蛋白是一种重要的转铁蛋白，背负着调节机体铁离子平衡的重要作用，可 W维持机体铁的运输和代谢，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节等生物活性。是生物体需 要的重要蛋白。
[0004] 卵转铁蛋白运输铁是将铁离子在体内进行全面的运输，将铁离子送到需要的部位 后，便于铁离子分离，血红蛋白的合成所需的铁离子便是其提供的，有研究表明卵转铁蛋白 可W改善缺铁性贫血症状。 阳〇化]其次卵转铁蛋白还有抗菌的作用，它通过馨合细菌生长所需的铁离子来抑制细菌 的繁殖；卵转铁蛋白存在抗菌多肤。对于能够引起病变的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙口 氏菌等都能够阻碍其活性的作用，还能够对病毒起到抑制作用，如抗马立克氏病病毒、瘤疹 病毒等病毒，而且具有比血清转铁蛋白和乳转铁蛋白更好的效果。
[0006] 还有抗氧化的作用，能够抑制自由基的产生，氧化损伤在SOD试验中，卵转铁蛋白 抑制02-的净化活性比抗坏血酸盐、血清蛋白和所知的抗氧化剂更高，卵转铁蛋白与金属 离子结合后的比未结合金属离子的卵转的铁蛋白抗氧化活性更高，且清除氧自由基的能力 最强是结合化化的卵转铁蛋白。
[0007] 免疫调节作用，卵转铁蛋白能够促进双歧杆菌的繁殖，W双歧杆菌促生长因子的 作用存在，可W促进机体对营养物质的吸收，成为肌肉细胞营养的一种重要因子，可W促进 细胞的生长和分化，从而增强机体的免疫力，卵转铁蛋白在体外能够调节鸡巨隧细胞和异 嗜细胞、小鼠巨隧细胞和脾淋己细胞。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的制备方法，和使用 制得的抗体的免疫分析方法。本发明提供的技术方案是：
[0009] -种卵转铁蛋白兔多克隆抗体的制备方法，包括W下步骤：
[0010] 1)抗体制备
[0011] 免疫动物选用雄性西兰大耳白兔，月龄约3个月，体重约1. 5公斤，免疫原为卵转 铁蛋白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后进行四次加强免疫，加强免疫分别于 初次免疫后2周、4周和6周和8周，五次免疫一周后采用股动脉取全血，具体做法是： 阳01引 （1)初次免疫：免疫原与弗氏完全佐剂W1 :1的体积混合，经密封性良好的玻璃注 射器乳化充分，直到免疫原与佐剂完全混匀并呈乳白色状态为止，免疫剂量为Img/只，进 行动物免疫；
[0013] (2)加强免疫：免疫原和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，进行动物免疫，免疫剂 量为0. 5mg/只；
[0014] (3)免疫完成时将采集到的血液先在37°C下凝固化，然后保存于4°C冰箱中过夜， 使血块收缩，上清液析出，取上清，-2(TC冰箱保存备用； 阳〇1引。抗体纯化
[0016] (1)将实验中所需的所有试剂超声20分钟；
[0017] (2)平衡纯化柱：首先用冲洗管路1-化，选用的试剂为抑7. 4的憐酸缓冲液，流 速0. 5-1. 5mL/min，管路冲洗完毕后取纯化柱，并将封柱用的一部分乙醇溶液慢慢倒出，留 下柱高度大约S分之一的乙醇溶液；将纯化柱与蛋白纯化仪连接好，用抑7. 4的憐酸缓冲 液冲洗平衡柱子，流速设定为0. 5-1. 5mL/min;观察程序屏幕中紫外和电导两条基线为平 行线时，即可停止冲柱；
[0018] (3)上样：取0.5-1.5mL待纯化的兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体血清与憐酸缓冲液 等体积稀释，流速设置为0. 2-0. 8mL/min，然后将混合液上柱；
[0019] (4)洗脱：出现杂蛋白峰后，继续用憐酸缓冲液冲洗柱子，至基线达到平衡后停 止；用抑2. 7的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗柱子，流速0. 5-1. 5血/min,此时与Protein A-Se地arose4B结合的免疫球蛋白被洗脱下来；
[0020] (5)收集：加入洗脱液后，当基线开始发生变化时就开始收集洗脱液，每个安道管 收集管收集0. 5-1. 5血液体，直至曲线不发生变化，停止收集；收集液经分光光度计280nm 处读数，弃去吸光度值<0. 4的收集液，将吸光度值〉0. 4的液体混匀后立即用化is-HCl迅 速调节抗体，使其pH至7. 0 ; W21] (6)处理纯化柱：待抗体纯化结束后，用0.05-0. 2mol/L醋酸迅速冲洗柱子 l-3min，流速3-8mL/min，然后再用憐酸盐缓冲液平衡柱子，流速l-8mL/min，同时用抑试纸 测定流出缓冲液的抑值，直到其显示中性为止；最后用质量浓度为20%乙醇溶液冲洗纯化 柱20min，并使柱子中充满20%乙醇溶液，封存于4°C冰箱中；
[0022] (7)抗体保存：将纯化后的卵转铁蛋白抗体在4°C环境下用PBS透析S天，透析液 为0. 01M的PBS溶液，透析液每天换S到四次，透析后的抗体取出后与等体积的丙S醇混 匀，分装后于-20°C冰箱中保存备用。
[0023] 制备的兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体的免疫分析方法，包括如下步骤，
[0024] 1)包被：用包被液稀释卵转铁蛋白标准溶液，将其包被于96孔聚苯乙締的酶标板 中，100yL/孔，于4°C冰箱中解育12-1化后弃去孔中液体，PBST洗液洗板3次，每2分钟 一次；
[00对。封闭海孔加入200 ^1、0.5%脱脂乳粉作为封闭液，于37°(：烘箱中封闭比，取 出弃去封闭液，PBST洗液洗板3次，每2分钟一次；
[0026] 扣加样海孔加入50yL卵转铁蛋白标准溶液，再加入50yL兔抗卵转铁蛋白多 克隆抗体，抗体的稀释倍数为1 :10000,于37°c烘箱中竞争反应比，取出用PBST洗液洗板4 次，每2分钟一次；
[0027] 4)加酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗用PBS缓冲液稀释10000倍， 100yL/孔加入酶标板中，37°C烘箱反应30min，PBST洗液洗板4次，每分钟一次；
[0028] 5)显色：需提前15min将底物A放于底物槽中，总共洗板5次，第四次后加入底物 B，混匀海孔中加入100yL，于37°C烘箱中显色约15-20min;
[0029] 6)终止：在每孔中加50yL终止液终止反应；
[0030] 7)读数：用酶标仪读取吸光度值，采用450-650nm双波长方式； 阳03U8)绘制标准曲线。
[0032] 使用的溶液配方如下：
[0033] 包被液：0. 05mol/L碳酸钢-碳酸氨钢缓冲液，抑为9. 6:分别准确称取化2〔〇3 1. 60g，胞肥化2. 91g，然后加双蒸水定容至1000血，最后调抑至9.6。
[0034] 底物体系溶液灯MB-过氧化氨脈溶液）
[0035] 底物液A:准确称取无水醋酸钢8. 20g，P-糊精2. 50g，溶解于lOOOmL的双蒸水 中，然后准确称巧樣酸3. 23g调节抑至5. 0,待所有药品完全溶解后，准确称取过氧化氨脈 428. 6mg，并将其加入已配制好的溶液中。于4°C冰箱中保存，使用时需提前15min取出，待 恢复至室溫方可使用。
[0036] 底物液B :准确称取lOOmg