标准曲线：抑制率曲线图的X轴为卵转铁蛋白浓度值，Y轴为相应的抑制 率，标准曲线是典型的S型曲线，IC50定义为抑制率为50%时对应的卵转铁蛋白浓度。
[0086] 灵敏度：在确定的最优条件下，建立了如附图1所示的卵转铁蛋白间接竞 争化ISA方法的标准曲线，从图中可W得出该方法的灵敏度，其半抑制浓度IC50值为 619. 26±65. 6ng/mL。
[0087] 特异性：本实验使用卵转铁蛋白抗体对10种日常的易致敏食品的蛋白进行了交 叉反应检测，目的是检查抗体的特异性，交叉反应率越小，表明抗体的特异性越好。如表4 所示，卵转铁蛋白与白蛋白有交叉，而它与其他几种常见的过敏原蛋白没有交叉反应。
[0088] 表4卵转铁蛋白抗体与其他交叉反应
[0089] Table4Cross-reactivityofantibodyofOVTwithselectedcommonfoods
[0090]
阳ow] 精密度：
[0093] 精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之 间的接近程度。在化ISA检测中，精密度用变异系数来衡量。变异系数用（CV%)来表示， 表示测量结果中随机误差大小的程度。
[0094] 本发明选择6个不同浓度的卵转铁蛋白溶液进行分析，分别考查板内变异和板间 变异，对建立的卵转铁蛋白间接竞争酶联免疫检测方法进行精密度测试。
[0095] 板内变异：选择6个不同浓度的卵转铁蛋白进行间接竞争酶联免疫检测方法分 析，每个浓度在同一块酶标板内做5个重复，按照建立的酶联免疫检测方法对每个浓度进 行分析，测定其的吸光度值，并计算抑制率，变异系数。结果如下表5。
[0096] 表5卵转铁蛋白间接竞争ELISA板内变异（n= 5)
[0097] T油le5Variancein-plateoficELISAforOVT(n= 5)
[0098]
[0099] 板间变异：取6个不同浓度的卵转铁蛋白标准溶液，进行间接竞争酶联免疫检测 方法分析。每个浓度每天进行一次间接竞争化ISA分析，综合5天共5次测得的抑制率并 计算出变异系数，结果见表6。 阳100] 表6卵转铁蛋白间接竞争化ISA板间变异（n= 5) 阳 101] T油le6Varianceinter-plateoficELISAfor0VT(n= 5) 阳 102]
[0104] W上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用W限制本发明创造，凡在本 发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造 的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 抗体制备 免疫动物选用雄性西兰大耳白兔，月龄约3个月，体重约1. 5公斤，免疫原为卵转铁蛋 白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次 免疫后2周、4周和6周和8周，五次免疫一周后米用股动脉取全血，具体做法是： (1) 初次免疫：免疫原与弗氏完全佐剂以I: 1的体积混合，经密封性良好的玻璃注射 器乳化充分，直到免疫原与佐剂完全混匀并呈乳白色状态为止，免疫剂量为Img/只，进行 动物免疫； (2) 加强免疫：免疫原和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，进行动物免疫，免疫剂量为 0? 5mg/ 只； (3) 免疫完成时将采集到的血液先在37°C下凝固2h，然后保存于4°C冰箱中过夜，使血 块收缩，上清液析出，取上清，-20 °C冰箱保存备用； 2) 抗体纯化 (1) 将实验中所需的所有试剂超声20分钟； (2) 平衡纯化柱：首先用冲洗管路l_2h，选用的试剂为pH7.4的磷酸缓冲液，流速 0. 5-1. 5mL/min，管路冲洗完毕后取纯化柱，并将封柱用的一部分乙醇溶液慢慢倒出，留下 柱高度大约三分之一的乙醇溶液；将纯化柱与蛋白纯化仪连接好，用pH7. 4的磷酸缓冲液 冲洗平衡柱子，流速设定为〇. 5-1. 5mL/min;观察程序屏幕中紫外和电导两条基线为平行 线时，即可停止冲柱； (3) 上样：取0. 5-1. 5mL待纯化的兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体血清与磷酸缓冲液等体 积稀释，流速设置为〇. 2-0. 8mL/min，然后将混合液上柱； (4) 洗脱：出现杂蛋白峰后，继续用磷酸缓冲液冲洗柱子，至基线达到平衡后停 止；用pH2. 7的甘氨酸-盐酸缓冲液冲洗柱子，流速0. 5-1. 5mL/min，此时与Protein A-Sepharose4B结合的免疫球蛋白被洗脱下来； (5) 收集：加入洗脱液后，当基线开始发生变化时就开始收集洗脱液，每个安道管收集 管收集〇. 5-1. 5mL液体，直至曲线不发生变化，停止收集；收集液经分光光度计280nm处读 数，弃去吸光度值< 0. 4的收集液，将吸光度值> 0. 4的液体混匀后立即用Tris-HCl迅速 调节抗体，使其pH至7. 0 ; (6) 处理纯化柱：待抗体纯化结束后，用0. 05-0. 2mol/L醋酸迅速冲洗柱子l-3min，流 速3-8mL/min，然后再用磷酸盐缓冲液平衡柱子，流速l-8mL/min，同时用pH试纸测定流出 缓冲液的pH值，直到其显示中性为止；最后用质量浓度为20%乙醇溶液冲洗纯化柱20min， 并使柱子中充满20%乙醇溶液，封存于4°C冰箱中； (7) 抗体保存：将纯化后的卵转铁蛋白抗体在4°C环境下用PBS透析三天，透析液为 0.OlM的PBS溶液，透析液每天换三到四次，透析后的抗体取出后与等体积的丙三醇混匀， 分装后于_20°C冰箱中保存备用。2. -种使用如权利要求1~3所述的制备方法制备的兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗 体的免疫分析方法，其特征在于：包括如下步骤， 1)包被：用包被液稀释卵转铁蛋白标准溶液，将其包被于96孔聚苯乙烯的酶标板中， 100yL/孔，于4°C冰箱中孵育12-16h后弃去孔中液体，PBST洗液洗板3次，每2分钟一次； 2) 封闭：每孔加入200iil、0.5%脱脂乳粉作为封闭液，于37°C烘箱中封闭lh，取出弃 去封闭液，PBST洗液洗板3次，每2分钟一次； 3) 加样：每孔加入50yL卵转铁蛋白标准溶液，再加入50yL兔抗卵转铁蛋白多克隆 抗体，抗体的稀释倍数为1 :1〇〇〇〇,于37°C烘箱中竞争反应lh，取出用PBST洗液洗板4次， 每2分钟一次； 4) 加酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗用PBS缓冲液稀释10000倍， 100yL/孔加入酶标板中，37°C烘箱反应30min，PBST洗液洗板4次，每分钟一次； 5) 显色：需提前15min将底物A放于底物槽中，总共洗板5次，第四次后加入底物B，混 匀；每孔中加入100yL，于37°C烘箱中显色约15-20min; 6) 终止：在每孔中加50yL终止液终止反应； 7) 读数：用酶标仪读取吸光度值，采用450-650nm双波长方式； 8) 绘制标准曲线。3.根据权利要求2所述的免疫分析方法，其特征在于：步骤1)中，卵转铁蛋白的包被 量为0.03yg/孔。
【专利摘要】本发明提供了一种兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法，所述制备方法主要过程为卵转铁蛋白兔直接免疫新西兰大耳白兔，经过五次免疫后股动脉取全血，获得卵转铁蛋白抗体血清；通过优化抗体包被量，检测抗体的稀释倍数，封闭液以及样品缓冲溶液的PH值建立卵转铁蛋白间接竞争ELISA方法。本发明制备的抗体效价较高，抑制率较好，建立的方法灵敏度和精密度较好。
【IPC分类】G01N33/531, G01N21/31, G01N33/68
【公开号】CN105181954
【申请号】CN201510658433
【发明人】王硕, 生威, 李晶, 刘冰, 陆旸
【申请人】天津科技大学, 天津出入境检验检疫局工业产品安全技术中心
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月12日