一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于双向电泳技术领域，具体涉及一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质组(proteome)指“细胞、组织或机体内的基因在特定生理条件下表达的所有蛋白质”，蛋白质组学(proteomics)是对一个机体的全部蛋白质进行系统的研究，包括蛋白质的变化、翻译后修饰及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。蛋白质组学研究可以从蛋白质水平上对生物体的各种生理过程有更全面的认识，已成为生命科学研究的热点，而双向电泳(Two-dimens1nal electrophoresis，2-DE)是目前蛋白质组学研究中常用的蛋白质分离技术之一。以双向电泳技术为核心的蛋白质组学已广泛应用于生物学、生物化学和生物医学研究中，现逐渐延伸到水产科学及食品科学方面。
[0003]罗非鱼具有生长速度快、繁殖能力强、食性杂、抗病力强等特点，且骨刺少、肉质厚，是我国主要的淡水鱼养殖产品之一。不同品种和不同组织的双向电泳条件也各不相同，已有关于大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)肝脏、大菱鲜(Scophthalmusmaximus)表皮、大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肝脏、斑节对?!下(Penaeus monodon)血淋巴蛋白质双向电泳体系建立的研究，尚未有关于罗非鱼肌肉蛋白质双向电泳体系建立的报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，该方法通过双向电泳体系能获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图並L曰O
[0005]本发明上述所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，包括如下步骤:
[0006](I)双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的制备
[0007]选取罗非鱼肌肉组织，采用液氮研磨法研磨后，得粉末状组织，将粉末状组织用蛋白提取裂解液冰浴超声提取后，离心，取上清液，将上清液用丙酮沉淀、离心，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀用蛋白提取裂解液溶解后离心，取上清液即得双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质；
[0008](2)检测双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度
[0009]采用Bradford法检测步骤(I)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度；
[0010](3)双向电泳
[0011]等电聚焦电泳:选取24cm、pH值为4?7的等电聚焦胶条，根据步骤⑵中的可溶性罗非鱼蛋白质的浓度，取一定体积的可溶性罗非鱼蛋白质至其质量为135?145yg，配制成上样液，将上样液置于等电聚焦仪进行等电聚焦电泳；
[0012]胶条平衡:将等电聚焦电泳后的胶条置于平衡液中进行平衡；
[0013]十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳:胶条平衡结束后，将其取出置于电泳缓冲液中浸泡，用含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖溶液封胶，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶进行SDS-PAGE电泳；
[0014]⑷凝胶染色
[0015]采用硝酸银染色法对SDS-PAGE凝胶进行染色；
[0016](5)图谱扫描
[0017]用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。
[0018]在上述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法中:
[0019]步骤⑴中所述的蛋白提取裂解液包括以下组分:2.0mol -L 1的硫脲、7.0mol -L 1的尿素、质量体积百分含量为4%的CHAPs、65mmol.L 1DTTU^ pH为3?10的B1-Lyte。
[0020]步骤⑵中采用Bradford法检测步骤(I)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度的具体过程优选是:取BSA配制一组具有浓度梯度的BSA溶液制作标准曲线，取步骤(I)中获取的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质，根据制作的标准曲线，计算双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度。
[0021]采用Bradford法检测时，每个样品中均加入有Bradford染色液。
[0022]步骤(3)中所述的上样液包括以下组分:135?145 μ g蛋白质、I %二硫苏糖醇、I %胶条缓冲液和I %溴酚蓝。
[0023]其中，胶条缓冲液的成分包括pH 3?10的B1-Lyte，载体两性电解质，是B1-RAD的一种市售产品，可以增加蛋白质的溶解性。
[0024]本发明上样液中采用135?145 μ g的蛋白质，蛋白质的上样量是根据胶条的选择、染色方法及样品自身的特性来设定的，如果上样量过多会造成图谱中蛋白质斑点堆积，分离效果不好，上样量过少则会造成某些低丰度蛋白斑点缺失，本发明中经过试验发现，选择上样量在135?145 μ g范围内图谱分辨率高且斑点清晰。
[0025]步骤(3)中等电聚焦电泳时，等电聚焦仪的参数优选为:500V线性升压60min，1000V 快速升压 60min，10000V 快速升压 180min，1000Vh 快速聚焦 250min。
[0026]胶条的长度和pH不同其所需的等点聚焦参数也不同，窄pH范围及较长的胶条需要较大的电压。采用分步升压的方式达到最终的聚焦电压，能够从胶条中清除样品中的离子成分，同时减少胶条因电流而产生的热量。本发明通过试验发现，采用上述等电聚焦仪参数时，图谱较好。
[0027]步骤(3)中将等电聚焦电泳后的胶条置于平衡液中进行平衡时，依次置于平衡液I和平衡液2中，分别平衡12?18min。
[0028]平衡液I包括以下组分:6mol.L 1尿素、2 % SDS、pH值为8.8的50mmol.L 1Tris-HCUO^ 的甘油、I % DTT0
[0029]平衡液2包括以下组分:6mol*L 1 尿素、2% 303、？!1为8.8的50臟01 *L 1Tris-HCl,20%甘油、2.5% IAA (碘乙酰胺)。
[0030]步骤(3)中所述十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶的浓度为12.5%，SDS-PAGE电泳时，电泳起始功率为2W/胶，60min后升至17W/胶，直到溴酚蓝跑到下缘时结束。
[0031 ] 步骤(4)中采用硝酸银染色法对SDS-PAGE凝胶进行染色的具体过程是:SDS_PAGE电泳后的凝胶用固定液固定120?150min，接着加入敏化液敏化45?75min，并分别用蒸馏水漂洗3?5次，每次8?12min，继续用银染液染色45?75min，并用蒸馏水漂洗2?3次，每次50?70s后以显色液显色8?lOmin，最后用终止液终止显色40?60min，并用蒸馈水漂洗2?3次，每次25?35min。
[0032]所述固定液的组成为:100mL无水乙醇、25mL冰醋酸，以蒸馈水定容至250mL ;所述敏化液的组成为:75mL无水乙醇、17g无水乙酸钠、0.788g五水硫代硫酸钠，以蒸馈水定容至250mL ;所述银染液的组成为:0.625g硝酸银，以蒸馏水定容至250mL ;所述显色液的组成为:6.25g碳酸钠，100 μ L质量百分含量为37%的甲醛溶液，以蒸馏水定容至250mL ;所述终止液的组成为:3.65g Na2EDTA.H2O,以蒸馏水定容至250mL。
[0033]本发明具有如下优点:本发明建立了一种易于操作、适于罗非鱼肌肉蛋白质的双向电泳体系以获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱的方法，该方法为后续罗非鱼肌肉蛋白质组学的研究奠定了基础，也为其它鱼类肌肉蛋白质组学研究提供了参考。
【附图说明】
[0034]图1是本发明实施例1中冰温条件下贮藏Od的用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱；
[0035]图2是本发明实施例2中冰温条件下贮藏1d的用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱；
[0036]图3是本发明实施例3中冰温条件下贮藏20d的用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。
【具体实施方式】
[0037]以下实施例中，如无特殊指明，用量或浓度按照本领域教科书中常规的质量百分含量、体积百分含量或质量体积百分含量配制的。
[0038]实施例1贮藏Od的罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱
[0039]本实施例提供的利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，包括如下步骤:
[0040](I)罗非鱼肌肉蛋白质样品的制备
[0041]将冰温条件下贮藏Od的罗非鱼肌肉洗净混合剪碎备用，在研钵中倒入液氮预冷，然后将碎肉组织置于研钵中，迅速加入液氮，待液氮不再沸腾后迅速进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而无明显颗粒，得粉末状组织。
[0042]在粉末状组织中加入蛋白提取裂解液，置于I %功率冰浴超声8次后于4°C，12000r.min 1条件下离心20min，收集上清液分装3管(每管250 μ L)，加入ImL丙酮沉淀12h后于4°C，12000r *min 1条件下离心20min，倾去上清液后低温自然干燥，得到蛋白质团块。
[0043]随后在蛋白质团块中加入500 μ L蛋白提取裂解液，2 %功率超声助溶后于4°C，12000r.min 1条件下离心20min，取上清液即为双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质。
[0044]其中蛋白提取裂解液包括以下组分:7mol.L 1尿素、2mol.L 1硫脲、4% CHAPS,65mmol.L 1DTTU^ pH 3 ?10 的 B1-Lyte0
[0045](2)蛋白质定量
[0046]分别取5、10、15、20、25、30、35 μ g的BSA制作标准曲线，待测样品取4 μ L，双复管测定，每支管加入ImL Bradford进行染色，漩涡震荡充分混匀后静置5min，测定吸光度值，根据标准曲线，测得双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度。
[0047](3)双向电泳
[0048]等电聚焦电泳:选用24cm，pH 4?7等电聚焦胶条，根据可溶性罗非鱼蛋白质的浓度，取一定体积的可溶性罗非鱼蛋白质至其质量为140 μ g，配制成上样液，将上样液置于等电聚焦仪中进行等电聚焦电泳，上样液包括以下组分:140 μ g蛋白质、I %二硫苏糖醇、1%胶条缓冲液、1%溴酚蓝、蛋白提取裂解液补充体积至455 μ L ;等电聚焦电泳程序设置为:500V线性升压60min，1000V快速升压60min，10000V快速升压180min，10000V快速聚焦 250min。
[0049]胶条的平衡:等电聚焦完成后，取出胶条，用滤纸吸取胶条表面多余液体，依次放入8mL平衡液l、8mL平衡液2中，于摇床上分别平衡15min。
[0050]其中平衡液I包括以下组分:6mol.L 1尿素、2 % SDS、pH值为8.8的50mmol.L 1Tris-HCUO %的甘油、I % DTT ;平衡液2包括以下组分:6mol.L 1尿素、2%SDS、pH 为 8.8 的 50mmol.L 1Tris-HCUO^甘油、2.5% IAA0
[0051]十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):胶条平衡结束后，将其取出置于电泳缓冲液中浸泡5s，将胶条正极与电泳仪正极方向一致，胶条下端紧密接触二向胶面，用含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖溶液封胶，采用浓度为12.5%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶进行SDS-PAGE电泳，电泳起始功率为2W/胶，60min后升至17W/胶，直到溴酚蓝跑到下缘时结束(约270min)。
[0052]其中电泳缓冲液的组成为:10倍的电泳缓冲液成分I % SDS、250mM T