ris-base、1.92M甘氨酸，用时用水稀释成I倍的。
[0053]含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖溶液中溴酚蓝用量为0.001 %，溴酚蓝事先配成I %的，需用时按比例取一定体积。
[0054](4)凝胶染色
[0055]采用硝酸银染色法对凝胶进行染色，SDS-PAGE电泳后的凝胶用固定液(10mL无水乙醇、25mL冰醋酸，以蒸馏水定容至250mL)固定120?150min ;随后加入敏化液(75mL无水乙醇，17g无水乙酸钠，0.788g五水硫代硫酸钠，以蒸馈水定容至250mL)敏化45?75min ;随后分别用250mL蒸馏水漂洗3?5次，各1min ;随后用银染液(0.625g硝酸银，以蒸馈水定容至250mL)染色45?75min ;蒸馈水漂洗2?3次，各Imin后以显色液(6.25g碳酸钠，100 μ L 37%甲醛溶液，以蒸馏水定容至250mL)显色8?1min ;最后用终止液(3.65g Na2EDTA.Η20，以蒸馏水定容至250mL)终止显色40?60min，蒸馏水漂洗2?3次，各 30min。
[0056](5)图谱扫描
[0057]用扫描仪(Image Scanner III扫描仪，美国GE公司)对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。
[0058]用扫描仪对凝胶进行扫描获得贮藏时间Od的罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱如图1中所示。从图1中可以看出，所得二维电泳图谱共含1490个蛋白质点，分辨率高，重复性好，背景清晰，基本无纵横条纹。
[0059]实施例2贮藏1d的罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱
[0060](I)罗非鱼肌肉蛋白质样品的制备
[0061]将冰温条件下贮藏1d的罗非鱼肌肉洗净混合剪碎备用，在研钵中倒入液氮预冷，然后将碎肉组织置于研钵中，迅速加入液氮，待液氮不再沸腾后迅速进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而无明显颗粒，得粉末状组织。
[0062]在粉末状组织中加入蛋白提取裂解液，置于I %功率冰浴超声8次后于4°C，12000r.min 1条件下离心20min，收集上清液分装3管(每管250 μ L)，加入ImL丙酮沉淀12h后于4°C，12000r.min 1条件下离心20min，倾去上清液后低温自然干燥，得到蛋白质团块；随后加入500 μ L蛋白裂解液，2%功率超声助溶后于4°C，12000r.min 1条件下离心20min，取上清液备用。蛋白裂解液组成同实施例1。
[0063](2)蛋白质定量
[0064]分别取5、10、15、20、25、30、35 μ g的BSA制作标准曲线，待测样品取4 μ L，双复管测定。每支管加入ImL Bradford进行染色，漩祸震荡充分混勾后静置5min，测定吸光度值，根据标准曲线，检测蛋白质浓度。
[0065](3)双向电泳
[0066]选用24cm，pH 4?7等电聚焦胶条，根据(2)中检测到的可溶性罗非鱼蛋白质的浓度，取一定体积的可溶性罗非鱼蛋白质至其质量为135 μ g，配制成上样液，将上样液分别上样140yg后进行等电聚焦电泳，等电聚焦电泳上样液组成为:相应量蛋白质、1% 二硫苏糖醇、I %胶条缓冲液、I %溴酚蓝、蛋白提取裂解液补充体积至455 μ L ;等电聚焦电泳程序设置为:500V线性升压60min，1000V快速升压60min，10000V快速升压180min，10000V快速聚焦250min。
[0067]等电聚焦完成后，取出胶条，用滤纸吸取胶条表面多余液体，依次放入SmL平衡液l、8mL平衡液2中，于摇床上分别平衡15min。平衡液I和平衡液2组成同实施例1。
[0068]胶条平衡结束后，将其取出置于电泳缓冲液中浸泡5s，将胶条正极与电泳仪正极方向一致，胶条下端紧密接触二向胶面，用含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖溶液封胶，采用浓度为12.5%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，电泳起始功率为2W/胶，60min后升至17W/胶，直到溴酚蓝跑到下缘时结束。
[0069](4)凝胶染色
[0070]采用硝酸银染色法对凝胶进行染色，SDS-PAGE电泳后的凝胶用固定液固定150min ;随后加入敏化液敏化60min ;随后分别用250mL蒸馏水漂洗4次，各1min ;随后用银染液染色60min ;蒸馏水漂洗2次，各Imin后以显色液显色Smin ;最后用终止液终止显色45min，蒸馏水漂洗2次，各30min。敏化液、银染液、显色液、终止液等组成同实施例1。
[0071](5)图谱扫描
[0072]用扫描仪对凝胶进行扫描获得贮藏时间1d的罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱。
[0073]用扫描仪对凝胶进行扫描获得贮藏时间1d的罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱如图2中所示。从图2中可以看出，所得二维电泳图谱共含1344个蛋白质点，分辨率高，重复性好，背景清晰，基本无纵横条纹。
[0074]实施例3贮藏20d的罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱
[0075]与实施例2不同的是，罗非鱼肌肉样品为冰温条件下贮藏20d的罗非鱼肌肉样品。
[0076]用扫描仪对凝胶进行扫描获得贮藏时间20d的罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱如图3中所示。从图3中可以看出，所得二维电泳图谱共含1131个蛋白质点，分辨率高，重复性好，背景清晰，基本无纵横条纹。
[0077]从实施例1-3中可以看出，利用本发明中的双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，能获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。
[0078]以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。本技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
【主权项】
1.一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是包括如下步骤: (1)双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的制备 选取罗非鱼肌肉组织，采用液氮研磨法研磨后，得粉末状组织，将粉末状组织用蛋白提取裂解液冰浴超声提取后，离心，取上清液，将上清液用丙酮沉淀、离心，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀用蛋白提取裂解液溶解后离心，取上清液即得双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质； (2)检测双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度 采用Bradford法检测步骤(I)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度； (3)双向电泳 等电聚焦电泳:选取24cm、pH值为4?7的等电聚焦胶条，根据步骤(2)中的可溶性罗非鱼蛋白质的浓度，取一定体积的可溶性罗非鱼蛋白质至其质量为135?145yg，配制成上样液，将上样液置于等电聚焦仪进行等电聚焦电泳； 胶条平衡:将等电聚焦电泳后的胶条置于平衡液中进行平衡； 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳:胶条平衡结束后，将其取出置于电泳缓冲液中浸泡，用含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖溶液封胶，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶进行SDS-PAGE电泳； (4)凝胶染色 采用硝酸银染色法对SDS-PAGE凝胶进行染色； (5)图谱扫描 用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。2.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:步骤(I)中所述的蛋白提取裂解液包括以下组分:2.0mol.L1的硫脲、7.0mol.L1的尿素、质量体积百分含量为4%的CHAPs、65mmol *L 1DTTU^ pH为3?10的B1-Lyte03.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:步骤(2)中采用Bradford法检测步骤(I)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度的具体过程是:取BSA配制一组具有浓度梯度的BSA溶液制作标准曲线，取步骤(I)中获取的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质，根据制作的标准曲线，计算双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度。4.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:步骤(3)中所述的上样液包括以下组分:135?145yg蛋白质、1% 二硫苏糖醇、I %胶条缓冲液和I %溴酚蓝。5.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:步骤(3)中等电聚焦电泳时，等电聚焦仪的参数为:500V线性升压60min，1000V 快速升压 60min，10000V 快速升压 180min，1000Vh 快速聚焦 250min。6.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:步骤(3)中将等电聚焦电泳后的胶条置于平衡液中进行平衡时，依次置于平衡液I和平衡液2中，分别平衡12?18min。7.根据权利要求6所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是平衡液I包括以下组分:6mol.L1尿素、2% SDS、pH值为8.8的50mmol.L 1Tris-HCUO %的甘油、I % DTT ;平衡液2包括以下组分:6mol.L 1尿素、2%SDS、pH 为 8.8 的 50mmol.L 1Tris-HCUO^甘油、2.5% IAA08.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:步骤(3)中所述十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶的浓度为12.5%，SDS-PAGE电泳时，电泳起始功率为2W/胶，60min后升至17W/胶，直到溴酚蓝跑到下缘时结束。9.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:步骤(4)中采用硝酸银染色法对SDS-PAGE凝胶进行染色的具体过程是:SDS-PAGE电泳后的凝胶用固定液固定120?150min，接着加入敏化液敏化45?75min，并分别用蒸馏水漂洗3?5次，每次8?12min，继续用银染液染色45?75min，并用蒸馏水漂洗2?3次，每次50?70s后以显色液显色8?lOmin，最后用终止液终止显色40?60min，并用蒸馈水漂洗2?3次，每次25?35min。10.根据权利要求9所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是:所述固定液的组成为:100mL无水乙醇、25mL冰醋酸，以蒸馈水定容至250mL ；所述敏化液的组成为:75mL无水乙醇、17g无水乙酸钠、0.788g五水硫代硫酸钠，以蒸馏水定容至250mL ;所述银染液的组成为:0.625g硝酸银，以蒸馏水定容至250mL ;所述显色液的组成为:6.25g碳酸钠，100 yL质量百分含量为37%的甲醛溶液，以蒸馏水定容至250mL ;所述终止液的组成为:3.65g Na2EDTA.H2O,以蒸馏水定容至250mL。
【专利摘要】本发明公开了利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，包括如下步骤：(1)双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的制备；(2)检测双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度；(3)双向电泳，双向电泳包括等电聚焦电泳、胶条平衡、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳；(4)凝胶染色，采用硝酸银染色法对SDS-PAGE凝胶进行染色；(5)图谱扫描，用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。本发明建立了一种易于操作、适于罗非鱼肌肉蛋白质的双向电泳体系以获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱的方法，为后续罗非鱼肌肉蛋白质组学的研究奠定基础，也为其它鱼类肌肉蛋白质组学研究提供参考。
【IPC分类】G01N27/447
【公开号】CN105203615
【申请号】CN201510607516
【发明人】赵永强, 李来好, 杨贤庆, 李娜, 郝淑贤, 吴燕燕, 岑剑伟, 魏涯, 黄卉, 杨少玲
【申请人】中国水产科学研究院南海水产研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月22日