一种检测急性t淋巴细胞白血病幼稚t细胞的试剂盒、应用及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及细胞表型确认的专用试剂盒，具体涉及一种用于 分析急性T淋巴细胞白血病的白血病幼稚T细胞（leukemicblasticTcell，LBTC)表型 的试剂盒、应用及方法。
【背景技术】
[0002] 急性T淋巴细胞白血病（T-lineageacutelymphoblasticleukemia，T-ALL)在 儿童急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblasticleukemia，ALL)和成人ALL中分别占15% 和25%，异质性大。随着治疗方案的优化，儿童ALL的诱导缓解率和长期生存率得到了显著 提高，但T-ALL的预后仍然较差；成人ALL总体的5年无事件生存仅在30%左右，而T-ALL 的长期生存更差。由于目前微小残留检测水平有限，复发成为T-ALL患者治疗失败的主要 原因，也是影响长期生存的重要问题，复发后的患者，即使加强化疗或进行造血干细胞移植 等挽救措施，预后仍然较差，多数患者因此而丧生。
[0003]T-ALL是一种骨髓中幼稚T细胞恶性增长的疾病，T细胞分化发育的主要场所是 胸腺，正常机体胸腺内可见不同发育阶段的T细胞，胸腺内早期幼稚T细胞表达CD34、TdT、 ⑶7和胞浆⑶3 (c⑶3)，⑶45表达较弱，胞膜⑶3 (mCD3)阴性，随着细胞成熟，⑶34和TdT相 继消失，⑶45表达增强，mCD3转为阳性；骨髓中的正常T细胞为成熟T细胞，表型为⑶45st r+cCD3+CD7+mCD3+CD5+TdT-CD34-，CD34+ 和TdT+ 的幼稚T细胞比例极低。T-ALL患者主要 表现为骨髓或外周血中幼稚T细胞明显增加，常伴早期抗原CD34和TdT表达、mCD3多为阴 性或弱表达、⑶5阴性或弱表达、⑶4和⑶8双阴或双阳等，与成熟T细胞表型有明显差别， 这些标志均是LBTC相关免疫表型特点，用以区别正常T细胞。LBTC表型还可出现：抗原不 同步表达(如mCD3和⑶2同时弱阳性)、抗原系列不保真(髓系抗原⑶13和⑶33阳性)、抗 原表达缺失(如⑶2阴性）或抗原表达强度改变(如⑶7强表达、⑶45弱表达）等。
[0004] 由于发病率较低，有关初诊及治疗后T-ALL患者的检测报道较少，且多是采用三 色或四色抗体组合，在检测治疗后ALL-T幼稚细胞时国际上普遍根据初诊时的免疫表型， 设计治疗后检测的抗体，一般采用3-4管3色或4色抗体组合，如果没有初诊时的免疫表 型，则无法利用较少的抗体组合进行治疗后白血病细胞的检测。而国内部分患者由于初诊 时就诊医院的医疗条件较差，没有进行全面的抗原检测，缺乏初诊时免疫表型资料，对此类 患者，按照国际上的惯例则不能利用较少的抗体进行检测，需按照初诊时检测免疫表型的 方法，使用多种抗体对患者进行全面的抗原分析，费用较高。
[0005] 另一方面，早期文献报道，胸腺中的幼稚T细胞出现在骨髓或外周血时，称为异位 性表达。胸腺中早期幼稚T细胞表达⑶34和/或TdT，当时依据的主要抗原是TdT和⑶7， 因此认为当骨髓或外周血中TdT+CD7+幼稚T细胞比例增高时，则为微小残留病阳性，但对 于T-ALL治疗后骨髓中CD34+TdT+cCD3+的T细胞比例增高的样本，其是否是LBTC、是否说 明白血病细胞增加还是非特异性结合尚不清楚。因此，对治疗后患者检测LBTC时，如何准 确、快速、简单的对非特异结合的细胞进行排除性鉴别也是本领域的难题之一。
[0006] 可见，开发具有疾病特异性的、较少量抗体组合的试剂，广泛适用于初诊患者，同 时对于多数治疗后T-ALL患者、T-ALL复诊患者，可不依赖于初诊时的免疫分型资料，鉴别LBTC对本领域技术的进步具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞 的试剂盒、应用及方法，利用该试剂盒中的专用试剂和配套使用方法、借助七色流式细胞仪 的辅助，可以快速、准确地分析T-ALL患者LBTC的抗原表达，对T-ALL患者体内异常幼稚T 细胞快速、准确分类，还可作为组成用于制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品。
[0008] 本发明采取的技术方案是： 一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞 仪，所述试剂盒中配置了针对包括下述物质的单克隆抗体：TdT、c⑶3、⑶34、⑶5、⑶7、mCD3 和CD45,所述抗体分别带有荧光标记。
[0009] 优选的，所述针对TdT、c⑶3、⑶34、⑶5、⑶7、mCD3和⑶45的单克隆抗体依次带有 下述荧光标记：FITC、PE、PerCP-Cy5. 5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7和PacificBlue。
[0010] 优选的，所述试剂盒中还包括红细胞溶解液和和包含细胞固定液、破膜液的固定/ 破膜剂。
[0011] 本发明还提供上述试剂盒在制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的应用，对 样本依次进行下述预处理步骤： ① 将样本与CD34-PerCP-Cy5. 5、CD5-PE-Cy7、CD7-APC、mCD3-APC-Cy7和 CD45-PacificBlue混匀后避光室温孵育10-20分钟，得混合液I; ② 向混合液I加入红细胞溶解液，混匀后避光，室温放置5-10分钟，以1000-2000转 /分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入细胞固定液，混匀后避光孵育10-20min; ③ 加入pH为7. 2~7. 4的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上 清，向沉淀中加入破膜液，同时加入TdT-FITC和CCD3-PE，混勾，避光孵育5-10分钟； ④ 加入含血清0. 5%~2%的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分离心5-10分钟，弃上 清，向沉淀中加入pH为7. 2~7. 4的PBS缓冲液，混匀即得待测样本。
[0012] 优选的，所述待测样本采用流式细胞仪进行测试，并借助分析软件按下述步骤分 析数据： ① 先建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域设门标记为Pl; ② 对Pl内细胞建立c⑶3/SSC二维散点图，将c⑶3+SSC小细胞设门标记为P2 ; ③ 对P2门内细胞建立⑶45/c⑶3二维散点图，将c⑶3+⑶45+/dim+细胞设门标记为 P3 ； ④ 对P3门内细胞建立⑶34/⑶5、TdT/⑶7和⑶5/mCD3二维散点图，分别显示各群细胞 的比例及⑶34+和TdT+细胞在有核细胞中的比例，比较⑶34、TdT、⑶7、⑶5和mCD3的荧 光表达强度与正常T细胞的表达强度。
[0013] 本发明还提供了一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的方法，基于流式细 胞仪，所述方法包括以下步骤： (1) 对样本依次进行下述预处理： ① 将样本与CD34-PerCP-Cy5. 5、CD5-PE-Cy7、CD7-APC、mCD3-APC-Cy7和 CD45-PacificBlue混匀后避光室温孵育10-20分钟，得混合液I; ② 向混合液I加入红细胞溶解液，混匀后避光，室温放置5-10分钟，以1000-2000转 /分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入固定/破膜剂中细胞固定液，混匀后避光孵育 l〇-20min； ③ 加入pH为7. 2~7. 4的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上 清，向沉淀中加入破膜液，同时加入TdT-FITC和CCD3-PE，混勾，避光孵育5-10分钟； ④ 加入含血清0. 5%~2%的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分离心5-10分钟，弃上 清，向沉淀中加入pH为