7. 2~7. 4的PBS缓冲液，混匀即得待测样本； (2) 所述待测样本采用流式细胞仪进行测试，并借助分析软件按下述步骤分析数据： ① 先建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域设门标记为Pl; ② 对Pl内细胞建立c⑶3/SSC二维散点图，将c⑶3+SSC小细胞设门标记为P2 ; ③ 对P2门内细胞建立⑶45/c⑶3二维散点图，将c⑶3+⑶45+/dim+细胞设门标记为 P3 ； ④ 对P3门内细胞建立⑶34/⑶5、TdT/⑶7和⑶5/mCD3二维散点图，分别显示各群细胞 的比例及⑶34+和TdT+细胞在有核细胞中的比例，比较⑶34、TdT、⑶7、⑶5和mCD3的荧 光表达强度与正常T细胞的表达强度。
[0014] 上述技术方案中，本发明提供的试剂盒利用较少的抗体数量设计合适的抗体组 合，提供一组七色抗体组合，在七色流式细胞仪的基础上，运用本发明提供的方法，在一个 样本只需在同一试管中处理，特异性的设门分析，即可对LBTC的抗原表达情况综合的、准 确的分析，可有效鉴别正常T细胞、微量的幼稚T细胞及非特异性结合，所述七色抗体组合 可对所有初诊和复发T-ALL患者LBTC上的抗原表达进行鉴别并定量，适用于所有形态学完 全缓解的T-ALL患者。本发明提供上述试剂盒在制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中 的应用，作为诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的一种组成。
[0015] 采用本发明产生的有益效果在于：（1)采用本发明的试剂盒可对一个样本只用一 个试管就快速、准确地对LBTC的抗原表达进行分析及定量；（2)该试剂盒广泛适用于所有 T-ALL患者的微量LBTC分析；（3)采用本试剂盒提供的设门方法及多个抗原标志综合评判， 特异度高，敏感度高；（4)所需样本量少，即可得到检测结果，时间、成本都有效降低。
【附图说明】
[0016] 图1是采用本发明试剂盒对T-ALL患者LBTC的抗原表达进行设门分析； 图2是初诊T-ALL患者T细胞抗原表达的阳性比例。
【具体实施方式】
[0017] 本发明提供一种检测急性T淋巴细胞白血病中LBTC抗原表达的试剂盒，其包括针 对下列抗原表型的单克隆抗体：TdT、c⑶3、⑶34、⑶5、⑶7、mCD3和⑶45,依次分别带有下述 荧光标记：FITC、PE、PerCP-Cy5. 5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7和PacificBlue，各单克隆抗体的 荧光标记及成分等信息见下表1。
[0018] 表1单克隆抗体信息
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[0019] 上述试剂盒中还可以包括红细胞溶解液和细胞的固定/破膜剂，本实施例选用购 于BD公司的红细胞溶解液（10X，货号：555899)和购于Multisciences公司的固定/破 膜剂(货号：GAS006,包括A液20ml和B液20ml，A液作用为固定细胞，B液用于破膜，使抗 体顺利进入胞内，并使细胞形态仍然保存完整)，另配制pH为7. 2~7. 4的10XPBS缓冲液， IOXPBS缓冲溶液的配制方法如下：称取26. 3gNa2HPO4 .UH2OjOgNaH2PO4CH2O和85.Og NaCl，加水至1L，搅拌均匀。
[0020] 采用本发明的试剂盒对T-ALL患者骨髓T细胞的抗原表达进行分析测定的步骤如 下： 步骤一、试剂的制备 1、以蒸馏水：10XPBS缓冲液按照体积比9:1混合，将10XPBS缓冲液稀释为PBS缓 冲液，pH为7. 2~7. 4,备用； 2、 以体积比计，将IOX红细胞溶解液用PBS缓冲液稀释10倍，得IX红细胞溶解液， 备用； 3、 向PBS缓冲液中加入小牛血清和NaN3，使血清终浓度为0. 5%~2% (体积比)、似队终 浓度为〇. 1% (质量比)，得含血清〇. 5%~2%的PBS缓冲液，4 °C保存； 步骤二、待测样本的制备 1、 取一支洁净的流式细胞仪专用试管，向该试管中分别加入⑶34-PerCP-Cy5. 5 2. 5yL、CD5-PE-Cy7 2. 5yL、CD7-APC10ul、mCD3-APC-Cy7 2. 5yL和CD45-PacificBlue 2. 5yL，再加入150yL骨髓样本(含IXIO6个细胞)，轻轻混匀，室温(环境温度保持在22°C 左右）避光孵育15分钟； 2、 向试管中加入IX红细胞溶解液2mL，混匀后避光，室温放置8分钟，溶解红细胞； 3、 将试管放入离心机，以1500转/分、离心8分钟，弃上清液，向试管中加入固定/破 膜剂中A液100yL，震荡混勾，避光孵育15min; 4、 加入PBS缓冲液500yL，混匀，再放入离心机，以1500转/分、离心8分钟，弃上清 液，向试管中加入破膜剂中B液100yL，并同时加入5yLTdT-FITC和5ulc⑶3 -PE，轻 微混匀，避光孵育15min; 5、加入2mL含血清0. 5%~2%的PBS缓冲液，混匀，放入离心机，以1500转/分离心8分 钟，弃上清液，将未结合的游离抗体去除，再向试管中加入300yLPBS缓冲液，混匀即得待 测样本。
[0021] 步骤三、采用流式细胞仪进行检测 按照流式细胞仪的操作规程，对步骤二中制备的待测样本进行测试，获取750, 000个 有核细胞；用流式细胞仪分析软件进行数据分析。
[0022] 参见附图1，设门分析过程如下： ①先建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域划为Pl，以排除死细胞和细胞碎片；②对Pl细胞显示c⑶3/SSC散点图，将c⑶3+SSC小细胞划为P2,初步选定T细胞；③对P2门内细胞 显示CD45/cCD3散点图，将cCD3+CD45+/dim+细胞划为P3 ;④对P3内细胞显示CD34/CD5、 TdT/⑶7和⑶5/mCD3图，分别显示各群细胞的比例及⑶34+和TdT+细胞在有核细胞中的比 例，比较⑶34、TdT、⑶7、⑶5和mCD3的荧光表达强度与正常T细胞的表达情况。
[0023] 数据说明：计算抗原表达的阳性比例，〈20%定义为阴性（_)，多20%为阳性（ + )，其 中20%-60%和彡60%分别定义为部分表达（1+)和全部阳性（2+);以正常T细胞的抗原表达 强度为标准，当白血病细胞的抗原表达比正常T细胞抗原表达强的定义为强表达（str+)， 反之为弱表达（dim+)。初诊和复发患者的LBTC异常表型及所涉及的异常抗原表达情况见 表3及表4。
[0024] 采用上述方法，对收集的1146份样本进行LBTC抗原表达分析，样本来自2001年 11月-2013年3月在北京大学人民医院、北京大学血液病研究所收治的112例初诊T-ALL患 者，中位年龄20(1. 5-83)岁，共112份样本；2010年1月-2013年2月期间治疗后的T-ALL 患者140例，中位年龄22(2-61)岁，其中包括复发患者44例，106份样本，治疗后患者在不 同时期分别采集有多个样本。
[0025] 1.初诊及复发T-ALL患者的LBTC抗原表达比例分析 首先，分析112例初诊和44例复发T-ALL患者的抗原表达特点，结果见表2,所有患者 全部表达⑶45和c⑶3,几乎全部患者表达⑶7,大部分患者表达⑶5, 50%以上的患者表达 早期抗原⑶34和TdT，而mCD3的表达以阴性为主。初诊和复发患者⑶34的阳性表达率均 在50%-60%之间，初诊患者TdT的阳性表达较高，为74. 4%，复发患者TdT的阳性表达率略 低，为54. 5% ;初诊和复发患者的mCD3均以阴性表达为主，阴性率分别为53. 2%和95. 5%。 初诊患者TdT和⑶34的阳性表达、mCD3和⑶5的阴性表达均是LBTC的特点，可与正常T细 胞区分开来。
[0026] 表2初诊和复发T-ALL患者LBTC中抗原表