人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae, Cpn)作为衣原体属的一种重要的呼吸道病 原微生物，自从上个世纪80年代中期由Grayston等人正式命名，在随后的时间里被研究者 们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主，感染方式可能为人与人之间通过呼吸道分泌物 传播。5岁以下儿童极少受染，8岁以上儿童及青年易被感染，尤其是人群聚集处，如家庭、 学校、兵营中易流行，经血清流行病学调查，证实成人中至少有40%已受到该衣原体感染， 大部分为亚临床型。肺炎衣原体是专性细胞内寄生的微生物，寄居于人呼吸道和咽喉等处， 在儿童和成人中产生上呼吸道和呼吸道感染，常引起肺炎和支气管炎等呼吸道疾病。目前 研究表明，其还与动脉粥样硬化综合症、老年痴呆症、心肌炎、哮喘等疾病有关。临床上由于 其与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、X-射线检查等得 出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可 以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。
[0003] 尽管肺炎衣原体在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种 类极少。目前，肺炎衣原体感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检 测法。检测血清中肺炎衣原体IgG、IgA、IgM抗体常用的有5种方法：微量免疫荧光抗体 检测（MIF)，补体结合试验（CF)，重组酶免疫测定（rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验 (SeroCF - EIA)，OY酶免疫试剂盒（LoY - EIA)。这5种方法要求肺炎衣原体不同成分做为 抗原，而且肺炎衣原体抗体的检出只能说明该个体感染过肺炎衣原体，却不能反映体内是 否仍有肺炎衣原体活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果 进行判断，需要较长的时间。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员 操作、重复性差、检测时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需 要。
[0004] 核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应（PCR)，核酸杂交检测肺炎衣原体的特 异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测； PCR具有较高的敏感性，应用肺炎衣原体外膜蛋白基因片段的一对特异性引物对临床咽拭 子进行PCR测定，其结果与血清学检测具有较好的一致性。但PCR实验对实验室有特殊要 求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断 方法。
[0005] 抗原检测方法有鸡胚卵黄囊分离培养和细胞培养法（常用HL和Hep-2两种细 胞），然后采用荧光标记或酶标记抗体检测标本中的衣原体，但该法存在操作步骤复杂，细 胞培养时间长等明显缺陷，并不适合临床应用。近年也尝试直接应用于临床标本的检验，其 敏感性与标本采集有关：痰液和咽拭子涂片后用EIA可检测肺炎衣原体抗原的存在，其敏 感性、特异性和可重复性不理想，且仅限于急性呼吸道感染；酶联免疫吸附试验（ELISA)也 可以直接检出病原体，主要检测肺炎衣原体外膜蛋白-2,所用抗体为抗衣原体属特异性抗 体，不能直接识别肺炎衣原体，与"金标准"（MIF)相比，虽然很灵敏，特异性却不高。
[0006] 因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的人肺炎衣原体抗原快速检测法以满足临 床的检测需求就显得非常必要了。
【发明内容】
[0007] 本发明针对【背景技术】中现存的几种人肺炎衣原体在检测方式中遇到的技术瓶颈， 提出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的人肺炎衣原体量子点免 疫层析检测卡及其制备方法和应用。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术手段来实现的：
[0009] -种人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡，其特征在于：所述人肺炎衣原体量子 点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子 点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相 硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体；所述质 控线包被有抗兔IgG ;所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测 层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设 置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
[0010] 作为优选，本发明所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS 量子点。
[0011] 作为优选，本发明所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0012] 作为优选，本发明所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是6. 6-7. 7cm的 底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2. 5-3cm的吸水垫重 叠0. 2-0. 4cm ;所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0. 5-0. 8cm的结合垫重 叠0. 2-0. 4cm ;所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2. 5cm的样品垫重叠0. 2- 0. 4cm ;所述检测线与质控线的间距是0. 5-0. 8cm ;所述底板的宽度是0. 3-0. 5cm。
[0013] 作为优选,本发明所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
[0014] 一种基于上述的人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡的制备方法，其特征在于： 所述制备方法包括以下步骤：
[0015] 1)结合垫的制备：
[0016] I. 1)重组M98-His融合蛋白的制备、纯化：
[0017] I. I. 1)对人肺炎衣原体98KD表面蛋白进行生物信息学分析，获取其胞外结构域 中抗原表位最为丰富的肽段；
[0018] I. 1. 2)找到步骤I. I. 1)中所得到肽段对应的基因编码序列，并在序列的5'端及 3'端引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为m98 ;其基因序列如序列表所示；
[0019] 1. 1.3)将步骤1. 1.2)中所得到的m98按分子生物学方法克隆入表达载体 pET-28a(+)后转入大肠杆菌中表达重组M98-His融合蛋白；所述重组M98-His融合蛋白以 包涵体表达方式存在于菌体中；
[0020] I. 1. 4)用镍柱纯化步骤I. 1. 3)所得到的重组蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，以 Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0. 2mg/mL后备用；
[0021] 1. 2)兔及鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[0022] 1. 2. 1)以步骤I. 1. 4)中所得到的重组M98_His融合蛋白为完全抗原，分别免疫新 西兰大白兔及豚鼠；分别制备兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣原体 98KD膜蛋白抗血清；所述兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣原体98KD 膜蛋白抗血清的间接ELISA效价均大于I X IO5 ;
[0023] 1. 2. 2)采用Protein G亲和层析柱分别纯化兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血 清及鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血清中的多克隆抗体IgG ;
[0024] 1. 2. 3)用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定步骤1. 2. 2)所得到的二种多克 隆抗体IgG的浓度，将其蛋白浓度均调整为3mg/mL后备用；
[0025] 1. 3)量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针的制备与纯化：
[0026] 1. 3. 1)向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmol N-羟基琥珀酰亚胺和 300nmol碳二亚胺，以磷酸盐缓冲液定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min，37°C反应 30min后，透析去除过量的N-羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺；所述磷酸盐缓冲液中各组分 含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲 液的 pH = 7. 3 ;
[0027] 1. 3. 2)在活化的量子点中，加入4_12nmol的步骤1. 2)所制备的兔抗人肺炎衣原 体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇至终浓度为1. 5%，封 闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应Ih ;用0. 2μπι PES滤器过滤除去抗体聚集物，然 后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，除去未发生 偶联反应的抗体和反应中的副产物；收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于 2ml磷酸盐洗涤液中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下 离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于Iml磷酸盐保存液中，至此 制得量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针；
[0028] 所述磷酸盐洗涤液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢 钠、2g/L氯化钠、5ml/L吐温-20以及lg/L叠氮钠；所述磷酸盐洗涤液的pH = 7. 3 ;所述磷 酸盐保存液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠、2g/L氯化钠、 10g/L BSA以及lg/L叠氮钠；所述磷酸盐保存液的pH = 7. 3 ;
[0029] 1. 4)量子点标记抗体的负载：
[0030] 将聚酯纤维膜浸入步骤1. 3. 2)所得到的量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针 溶液中lh，取出，25°C干燥后4°C密封保存备用，至此制得结合垫；
[0031] 2)样品垫的制备：
[0032] 取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置 于生物安全柜内37°C通风干燥后，25°C密封干燥保存；至此制得样品垫；
[0033] 所述样品垫处理液中各组分含量分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢 钠、2g/L氯化钠、20g/L牛血清白蛋白（BSA)、10ml/L吐温-20、20g/L蔗糖以及5g/L聚乙烯 吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH = 7. 3 ;
[0034] 3)检测层的制备：
[0035] 3. 1)将步骤1. 2)制备的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体与抗兔IgG用 磷酸盐缓冲液均调整至终浓度为0. 5-2. 5mg/mL后备用；所述磷酸盐缓冲液中各组分含量 分别为：2. 9g/L磷酸氢二钠、0. 295g/L磷酸二氢钠以及2g/L氯化钠，所述磷酸盐缓冲液的 pH = 7. 3 ；
[0036] 3. 2)将稀释好的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷 头中，设置0. 8-2. 5 μ Ι/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装 入BIODOT划膜仪喷头中，设置0. 8-2. 5 μ Ι/cm的量按照与检测线0. 5-0. 8cm的间隔喷于硝 酸纤维素膜上作为质控线；
[0037] 3. 3)将喷有检测线以及质控线的硝酸纤维素膜在37°C干燥2h，4°C密封干燥保 存；至此制得检测层；
[0038] 4)底板的制备