[0039] 将PVC材质的底板按实际要求裁剪后备用；
[0040] 5)吸水垫的制备
[0041] 将吸水滤纸按实际要求裁剪后备用；
[0042] 6)人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡的组装：
[0043] 6. 1)将步骤4)所制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉；
[0044] 6. 2)将步骤3)所制备得到的检测层粘贴到底板的中部区域，并抹平膜面；
[0045] 6. 3)将步骤5)所制备得到的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层有 部分重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并抹平；
[0046] 6. 4)将步骤1)所制备得到的结合垫按部分重叠的方式重叠于硝酸纤维素膜的左 边缘处，同时将结合垫粘于底板上；
[0047] 6. 5)将步骤2)所制备得到样品垫则按部分重叠的方式重叠于结合垫的左边缘 处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并抹平；
[0048] 6. 6)将组装好的人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡进行裁剪，4°C密封干燥避 光保存；
[0049] 所述步骤6. 1)至步骤6. 6)均是在生物安全柜内进行操作。
[0050] 作为优选，本发明所采用的步骤1. 3. 2)中加入6nmol的步骤1. 2)所制备的兔抗 人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG ;
[0051] 作为优选，本发明所采用的步骤3.1)中将步骤1.2)制备的鼠抗人肺炎衣原体 98KD膜蛋白多克隆抗体与抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为I. 5-2. Omg/mL以 及 0· 5-1. 5mg/mL ;
[0052] 作为优选，本发明所采用的步骤3. 2)中，将稀释好的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋 白多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1. 0-2. 0 μ Ι/cm的量喷于硝酸纤维素膜上， 形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1. 0-2. 0 μ Ι/cm的量按 照与检测线〇. 5-0. 8cm的间隔喷于硝酸纤维素膜上作为质控线。
[0053] -种基于上述的人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡作为非诊断性检测人肺炎 衣原体的应用。
[0054] -种基于上述的人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡的非诊断性检测方法，其特 征在于：所述检测方法包括以下步骤：
[0055] 1)将待检样品用500 μ 1的样品处理液充分溶解后，取出120 μ L滴于检测卡的样 品垫上，15分钟后于紫外灯下观察检测结果；所述样品处理液中各组分含量分别为：磷酸 氢二钠 2. 9g/L、磷酸二氢钠 0· 295g/L、Nonidet P-4010ml/L，SDS lml/L 以及氯化钠 2g/L， 所述样品处理液的pH = 7. 3 ;
[0056] 2)若待检样品中含有人肺炎衣原体抗原，则与结合垫中的量子点标记的抗人肺炎 衣原体纳米探针结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋 白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结 合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二 条荧光质控线；
[0057] 若待检样品中无人肺炎衣原体抗原，则仅出现一条荧光质控线；若荧光质控线未 出现，则该检测卡失效。
[0058] 作为优选，本发明所采用的待检样品是包括但不限于咽拭子。
[0059] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0060] 1、本发明的检测人肺炎衣原体抗原的方法是将免疫层析与量子点标记技术综合 起来，利用本发明制备的高效价、高特异性多克隆抗体，通过激发荧光来对样品进行检测， 具有灵敏度高的特点（其对人肺炎衣原体的检测底线为lng/ml)，用其对临床样品的检测 结果与目前对该病原体的检测"金标准培养法的相比无统计学差异。
[0061] 2、本发明所用的抗体均是识别人肺炎衣原体特异性98KD表面抗原胞外保守区的 多克隆抗体，其特异性高，属于种特异性抗体，不与沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体起交叉反应， 同时其较目前最广泛使用的单克隆抗体而言制备成本低廉，因此，本发明检测成本较低。
[0062] 3、本发明检测方法简单，检测快速，易于判定，结果判定在20分钟内完成，既可以 用紫外检测仪进行定性检测，亦可结合CCD扫描等技术进行定量检测，检测成本低廉，克服 了现有技术（如ELISA)检测成本高、操作复杂繁琐、耗时长、且必需专业人员才能操作的不 足。
[0063] 4、由于检测卡检测的是人肺炎衣原体抗原而非抗体（抗体的出现需要感染几天 至几周以后），故该方法在人肺炎衣原体的早期临床诊断和防治、病原体亚型鉴别、流行病 学调查等方面具有很高的实用价值。
[0064] 5、本发明首次以人肺炎衣原体所独有的98KD表面膜蛋白作为目标抗原，其检测 特异性高，不与其他任何衣原体起交叉反应。而传统ELISA法的检测标的为Cpn外膜蛋 白-2 (0MP-2)，所用抗体为抗衣原体属特异性抗体，不能直接识别Cpn，其存在与鹦鹉热衣 原体、沙眼衣原体等起交叉反应的缺点。
[0065] 6、本发明检测方法所用的临床样本为呼吸道分泌物如痰液等，而非血液，可免除 婴幼儿患者抽血检查的痛苦与家长的心理负担，故较易于推广。
【附图说明】
[0066] 图1是本发明所提供检测卡的纵向剖面结构示意图；
[0067] 图2是本发明所提供检测卡的在完成组装后的结构示意图；
[0068] 其中：
[0069] 1-样品塾；2_结合塾；3_检测层；4_检测线；5_质控线；6_吸水塾；7_底板。
【具体实施方式】
[0070] 本发明的工作原理是：本发明是在免疫层析测定法（双抗体夹心）的前提下，以 多克隆抗体为基础，采用量子点标记探针技术，通过量子点标记技术研制检测人肺炎衣原 体抗原的量子点免疫层析检测卡。首先是兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体和鼠 抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体的制备、纯化以及量子点标记，其次为喷膜，然后 将检测卡各组成成分进行组装，最后制备人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡。本发明所 提供的检测卡具有敏感、快速和特异性好等特点，并且可定量检测，能进行样品的高通量筛 查，具有较好的市场应用前景。
[0071] 如附图1所示，本发明所提供了一种人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡，包括 样品垫1、结合垫2、检测层3、吸水垫6及底板7组成。结合垫2上包被有量子点标记的抗人 肺炎衣原体纳米探针；检测层3是喷有检测线4以及质控线5的固相硝酸纤维素膜简称NC 膜；检测线4包被有鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体；质控线5包被有抗兔IgG ; 量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点；吸水垫6材质为吸水滤纸；底 板7材质为PVC。
[0072] 其具体结构是：检测层长2cm，检测层粘贴在长度是6. 6-7. 7cm的底板表面中间 段；检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2. 5-3cm的吸水垫重叠0. 2-0. 4cm ;检测 层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0. 5-0. 8cm的结合垫重叠0. 2-0. 4cm ;结合垫与 粘贴在结合垫以及底板上的长度是2. 5cm的样品垫重叠0. 2-0. 4cm ;检测线与质控线间距 是0. 5-〇. 8cm ;底板的宽度是0. 3-〇. 5cm。
[0073] 其中，上述参数优选方案是：检测层3长2cm，粘贴在底板7长7. 3cm表面中间段， 此检测层右端与粘贴在底板7右末端的吸水垫6长3cm重叠0. 2cm，其另一端与结合垫2长 0. 6cm重叠0. 3cm ;结合垫2则与粘贴在底板7左端的样品垫（1)长2. 5cm重叠0. 3cm ;检 测层3上的检测线4及质控线5间距0. 7cm。整条检测卡的宽度为0. 4cm。
[0074] 制备上述人肺炎衣原体量子点免疫层析检测卡的方法，其主要步骤包括：
[0075] 一、结合垫的制备
[0076] (1)重组M98_His融合蛋白的制备、纯化：
[0077] 对人肺炎衣原体98KD膜蛋白进行生物信息学分析，获取人肺炎衣原体98KD膜蛋 白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列；在此二基因序列的5' 端及3'端分别引入酶切位点并分别化学合成全基因序列，同时标记记为m98。其基因序列 参见序列表。将该基因序列按常规方法克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组M98-His 融合蛋白。此融合蛋白以包涵体表达形式存在于基因工程菌体中。用镍柱纯化基因工程菌 菌体中的重组M98-His、融合蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，再以Bradford法测定蛋白质浓 度，调整蛋白浓度为〇. 2mg/mL后备用；
[0078] (2)兔及鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG的制备：
[0079] 以纯化的重组M98_His融合蛋白为完全抗原，按常规方法免疫新西兰大白兔及豚 鼠，分别制备兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血清及鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白抗血 清。该二种抗血清的间接ELISA效价均大于I X 105,用Protein G亲和层析柱分别纯化二 种抗血清中的多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并均调 整为3mg/mL后备用。其中兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG用作量子点标记 试验；鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体IgG用作检测线的包被。
[0080] (3)量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针的制备与纯化
[0081] 其操作步骤如下：向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmol N-羟基琥拍 酰亚胺（sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺（EDC)，以磷酸盐缓冲液（2. 9g/L磷酸氢二钠， 0. 295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠 ，pH 7. 3)定容为2ml，于旋转混合仪中，以15rpm/min, 37°C反应30min后，透析去除过量的活化剂（sulfo-NHS与EDC)。在活化的量子点中，加入 4-12nmol(优选为6nmol)的步骤（2)所制备的兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体 IgG，避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇（PEG2000-NH2)至终浓度为1.5%，封闭未反应的 活化羧基位点，继续避光反应lh。用0. 2 μ m PES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转 移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，除去未发生偶联反应的 抗体和反应中的副产物。收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐 洗涤液（2. 9g/L磷酸氢二钠，0. 295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，5ml/L吐温-20, lg/L叠 氮钠 ，pH 7. 3)中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心 15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于Iml磷酸盐保存液（2. 9g/L磷 酸氢二钠，0. 295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L BSA，lg/L叠氮钠 ，pH 7. 3)中，制得量 子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针。
[0082] (4)量子点标记抗体的负载
[0083] 将聚酯纤维膜浸入步骤（3)所得到的量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针溶 液中lh，取出，25°C干燥后