检测血液中微生物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术，具体微生检测方法，尤其涉及一种检测血液中微生物的方法。
【背景技术】
[0002]血培养是临床实验室重要的检测项目之一，由于菌血症、败血症的死亡率高达30-50%，因此，准确及时的培养结果对临床检测和治疗有重要意义。目前中国内血培养中细菌的阳性检出率仅为10%，其可能原因为:1、血液中的含菌量低；2、血液中的抗菌物质；3、抗生素的应用；4、培养条件的限制。目前市场上的血培养检测产品主要以0)2检测法为主，主要的测定技术有放射性标记技术、荧光检测技术和分光光度技术。因细菌在其生长代谢过程中会产生C02，这些技术的原理都是通过检测血液样品在培养过程中中是否有0)2的产生来判定血液中是否有微生物。但这种基于细菌产生C02的检测方法，会因为一些不能利用糖代谢的微生物(如非发酵菌)，其代谢过程不产生C02或产生的C02量极低，从而导致测定结果呈阴性。
[0003]2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作为一种特殊的氧化还原指示剂，可以捕捉细胞或细菌呼吸过程中产生的电子，从无色的氧化型变成紫色的还原型，从而可以检测出血液中不产生C02的微生物。用TTC作指示剂有阳性检出率高，检出时间短的优点，对于提高血培养技术有重要帮助。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题在于研究设计采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作为一种特殊的氧化还原指示剂来检测血液中是否含有微生物，达到提高血培养技术的效果。
[0005]本发明提供一种检测血液中微生物的方法，该方法包括下列步骤:
[0006](1)将2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)与血培养基加入血培养瓶，再加入35-40mL血培养基及2_4g树脂粒，所述2，3，5-三苯基氯化四氮唑在血培养基及树脂粒混合物中浓度为0.01-0.03g/mL ;或
[0007]2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡胶富氧膜中，制备成固体指示剂，并固定在血培养瓶底部，再加入35-40mL血培养基及2_4g树脂粒；所述2，3，5-三苯基氯化四氮唑在硅橡胶富氧膜中浓度为0.01-0.03g/mL ；
[0008](2)血培养瓶于121°C，灭菌20min ；
[0009](3)向血培养瓶中加入血液样品，在34_36°C条件下培养0_5天；
[0010](4)检测血培养瓶中指示带的光反射强度，绘制光反射强度曲线，根据光反射强度曲线确定微生物生长结果。
[0011]本发明方法所述步骤(1)硅橡胶富氧膜为:25mL的聚二甲基硅氧烷、750yL正桂酸乙酯、100 μ L 二月桂酸二丁基锡和1.25mL环己烷混合物。
[0012]所述步骤(l)TTC先用等质量的单蒸水溶解再应用。
[0013]所述步骤⑴血培养基35_40mL混合2_4g树脂粒；所述血培养基选自肉汤培养基、大豆酪蛋白培养基或胰酪胨大豆肉汤培养基,优选为35mL肉汤培养基；所述树脂粒为0.2-0.8mm粒径的阳离子交换树脂粒或非离子吸附树脂粒，所述阳离子交换树脂粒选自732阳离子交换树脂粒、强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、超强性苯乙烯系阳离子交换树脂、大孔强碱性季铵型阳离子交换树脂；非离子吸附树脂粒选自聚苯乙烯型吸附树脂或Amberlite XAD-4非离子型大孔树脂。
[0014]所述步骤(4)590nm/750nm双波长的光波为用于检测将2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)与血培养基及树脂粒加入血培养瓶中的培养样品；570-610nm光波波长用于检测将2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡胶富氧膜制备成固体指示剂，并固定在血培养瓶底部，再加入血培养基及树脂粒的培养样品。
[0015]步骤(4)所述的指示带为:将2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)直接加入培养基的血培养瓶方法是指距离培养基表层2-3cm处的培养基；将2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡胶富氧膜的血培养瓶是指培养瓶底部的硅橡胶富氧膜。
[0016]用本发明对105例临床样本进行的血培养实验结果表明，本发明的阳性检出率为20%。现有技术为检出率为5%。
[0017]本发明的有益效果:
[0018](1)本发明创新的使用了 TTC作为检测微生物的指示剂，其特点为TTC可以捕捉微量的微生物释放的电子被还原形，从而显示出颜色浓郁的紫色，使实验结果容易观察。
[0019](2)本发明利用还原型TTC在波长为590nm处有强吸收峰的特点，选用570_610nm波长的光波作为检测波长，可以精确的判断血液中是否含有微生物。
[0020](3)本发明在临床应用上具有成本低、操作流程简单、检测时间短、阳性检出率高等优点，有较大的应用价值。
【附图说明】
[0021]图1为实施例1的血培养检测结果，图中纵坐标为光放射强度转变的电信号，单位:mv。横坐标为时间,单位:min。图中纵坐标值1.1处直线为阈值。满足:(1)检测信号值大于阈值；⑵检测曲线出现“S”形曲线两个条件，即为阳性信号。图1说明检测结果为阳性，血培养瓶中有细菌生长，阳性检出时间为13小时左右。
[0022]图2为实施例2的血培养检测结果，图中纵坐标为光放射强度转变的电信号，单位:mv。横坐标为时间，单位:min。图中纵坐标值1.2处直线为阈值。满足:⑴检测信号值大于阈值；⑵检测曲线出现“S”形曲线两个条件，即为阳性信号。图2说明检测结果为阳性，血培养瓶中有细菌生长，阳性检出时间为13小时左右。
[0023]图3为实施例2的血培养检测结果，图中纵坐标为光放射强度转变的电信号，单位:mv。横坐标为时间,单位:min。图中纵坐标值1.2处直线为阈值。满足:(1)检测信号值大于阈值；⑵检测曲线出现“S”形曲线两个条件，即为阳性信号。图3说明检测结果为阳性，血培养瓶中有细菌生长，阳性检出时间为62小时左右。
【具体实施方式】
[0024]实施例1 (本发明使用了 TTC作为检测微生物的指示剂方法)
[0025](1)取25mL的聚二甲基硅氧烷、750 μ L正桂酸乙酯、100 μ L 二月桂酸二丁基锡、
1.25mL环己烷和0.5g的TTC(TTC先用0.5g单蒸水溶解)于容器中混合均匀，并加入到血培养瓶底部，在35°C凝固，制备成硅橡胶富氧膜；
[0026](2)向血培养瓶中加入40mL肉汤培养基和4g732阳离子交换树脂粒(国药集团生产)，并于121。。，灭菌20min ；
[0027](3)于上海市华东医院住院部采集有发热(彡38°C )或低温(彡36°C )，寒战，白细胞增多体征的患者的血液标本用于实验。向血培养瓶中加入10mL血液样品；
[0028](4)将加入血