一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的n-连接寡糖结构的方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体的涉及一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的方法。
【背景技术】
[0002] 糖基化是一种将不同结构的糖链共价连接到蛋白质氨基酸序列特定位点的翻译 后修饰形式。根据连接方式不同可以将糖基化分为4种类型：N-聚糖（N-glycan，N-连 接寡糖）、〇-聚糖（〇-glycan，0-连接寡糖）、糖磷脂锚（glycophospholipidanchor,GPI Anchor)以及C-糖基化。蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即在糖基化发生过程 中会产生一系列结构相关的糖链（微不均一性）以及同一糖蛋白中的不同糖基化位点连接 有不同的糖链（点不均一性）。这是由于糖基化的发生不同于多肽链的合成，不受DNA的直 接控制，而是由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大，造 成即使同一个位点也会有糖基化程度不同的产物。同时糖链的结构高度分支以及大量异构 体的存在，对其结构鉴定存在大量困难。
[0003] 促红细胞生成素（Erythropoietin,ΕΡ0)是一类糖蛋白类激素，主要促进成熟红 细胞的生成。1989年，美国Amgen公司首次研制成功重组人促红细胞生成素（rhEPO)用 于治疗慢性肾衰竭引起的贫血，取得了令人瞩目的疗效。它也属于国际奥委会规定的违 禁药物，是一类兴奋剂。新红细胞生成刺激蛋白（Novelerythropoiesisstimulating protein，NESP)又称Darbepoetinalfa，Aranesp，是美国Amgen公司研制的长效ΕΡ0 制 剂，于2001年6月底获得欧洲药物评审委员会批准，用于慢性肾衰（chronicrenal failure，CRF)引起的贫血。NESP是高度糖基化的重组ΕΡ0的类似物，通过基因工程技术改 造，其N-连接糖基化位点增加到5个（Asn-24, 30, 38, 83, 88)，生物活性也大大提高。临床 表明，皮下静脉注射的ΕΡ0如果含有高度分支唾液酸化的糖链，血浆半衰期长达5~6h;然 而含有去唾液化的糖链，几分钟就会被肝脏所清除。正由于其糖基化修饰的程度对其生物 活性、血浆半衰期、免疫原性以及稳定性有重要影响。
[0004] 糖组学的分析是促红细胞生成素类药物质量控制的一个重要指标。蛋白糖基 化修饰的高度复杂性以及糖链缺乏紫外或荧光检测基团、离子化较困难，因此对糖链 的结构分析具有很大的挑战性。常见的糖链的分离分析方法包括亲水相互作用色谱 (Hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)、石墨化碳柱（Graphitizedcarbon chromatography)以及质谱（Massspectrometry,MS)等。质谱在糖链的定性定量研究中 具有很大的局限性，一方面是末端易丢失的单糖如唾液酸在质谱离子化过程中易丢失影响 定性，另一方质谱在糖链定量分析的也不太准确。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是为了克服新红细胞生成刺激蛋白上的N-连接寡糖 结构复杂、高度唾液酸化，难以鉴定结构的缺陷而提供了一种鉴定新红细胞生成刺激蛋白 的N-连接寡糖结构的方法。本发明的方法利用了激光诱导荧光毛细管电泳（CE-LIF)和弱 阴离子交换色谱的二维分离技术，大大提高了可被检测到的糖链类型数。同时二维分离技 术与糖苷外切酶测序技术（Exglycosidasesequencing)相结合，可以快速、高效、准确地实 现新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的鉴定。而且方法简单，灵敏度高，检出限低 于i摩尔数量级。本发明中对新红细胞生成刺激蛋白上的N-连接寡糖结构中占质量分数 95 %的糖链都进行了结构鉴定。
[0006] 本发明提供了一种新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其包 括以下步骤：
[0007] (1)对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1，3, 6-三磺酸 三钠盐荧光衍生（APTS荧光衍生），衍生产物分为两部分，一部分用广谱性的唾液酸 酶α(2-3, 6, 8, 9)-specificNeuraminidase进行酶切，另一部分用特异性的唾液酸酶 a(2-3)-specificNeuraminidase进行酶切，对每一部分的酶切产物分别通过激光诱导突 光毛细管电泳进行分离；从毛细管电泳的结果来确定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡 糖上末端唾液酸与N-连接寡糖上唾液酸以外的部分的连接方式；
[0008] (2)对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1，3, 6-三磺酸三钠 盐荧光衍生（APTS荧光衍生），然后用特异性的唾液酸酶a(2-3)-specificNeuraminidase 或广谱性的唾液酸酶α (2-3, 6, 8, 9)-specificNeuraminidase进行酶切使去唾液酸化，形 成中性的N-连接寡糖；然后将中性的N-连接寡糖分为三部分，第一部分用β1-4半乳糖苷 酶进行酶切，第二部分用β1-4半乳糖苷酶和β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，第三部分 用β1-4半乳糖苷酶、β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶进行酶切；对每一部分的酶切 产物分别用激光诱导荧光毛细管电泳分离；然后分别将每一部分的分离结果中的色谱峰迁 移时间转换为葡萄糖单元组成个数（英文缩写GU，也称寡糖聚合度）；然后结合每一部分所 用的糖苷外切酶的特异性，归属所述的中性的Ν-连接寡糖的结构；
[0009] (3)将新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖分为两部分，即第一部分和第二部 分；将第一部分先进行2-氨基苯甲酰胺衍生（2-ΑΒ衍生），然后用弱阴离子交换色谱法对 衍生后的产物进行梯度分离，使衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖中的中性 的Ν-连接寡糖、单唾液酸化的Ν-连接寡糖、二唾液酸化的Ν-连接寡糖、三唾液酸化的Ν-连 接寡糖及四唾液酸化的Ν-连接寡糖达到基线分离；第二部分不经2-氨基苯甲酰胺衍生，直 接用弱阴离子交换色谱法进行梯度分离，且梯度分离的条件同第一部分的梯度分离条件相 同，并按照第一部分的分离结果中的衍生后的二唾液酸化的Ν-连接寡糖、衍生后的三唾液 酸化的Ν-连接寡糖及衍生后的四唾液酸化的Ν-连接寡糖的出峰时间分别对第二部分的梯 度分离后的未经衍生的二唾液酸化的Ν-连接寡糖、未经衍生的三唾液酸化的Ν-连接寡糖 及未经衍生的四唾液酸化的Ν-连接寡糖进行收集；对收集的这三种Ν-连接寡糖都分别进 行以下操作：先脱盐，然后用8-氨基芘-1，3, 6-三磺酸三钠盐进行荧光衍生，然后将8-氨 基芘-1，3, 6-三磺酸三钠盐衍生产物分为两部分，一部分直接进行激光诱导荧光毛细管电 泳分离，另一部分先用特异性的唾液酸酶ct(2-3)-specificNeuraminidase或广谱性的唾 液酸酶α(2-3, 6, 8, 9)-specificNeuraminidase进行酶切，然后进行激光诱导突光毛细管 电泳分离，通过这两部分的电泳分离结果的对比来分析其结构。
[0010] 所述的用β1-4半乳糖苷酶和β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，其中两种酶 的酶切顺序不限，可以为β1-4半乳糖苷酶和β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶的混合酶的酶切， 也可以为依次用β1-4半乳糖苷酶和β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，也可以为依次用 β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶和β1-4半乳糖苷酶进行酶切。
[0011] 所述的用β1-4半乳糖苷酶、β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶进行酶切，其 中三种酶的酶切顺序不限，可以为三种酶混合在一起的混合酶的酶切；也可以先用其中任 意两种酶的混合酶进行酶切，然后再用三种酶中的最后一种酶进行酶切；也可以为依次采 用三种酶进行酶切，且所述的依次采用三种酶进行酶切中的三种酶的顺序不限，可以为任 意排列组合后的顺序。
[0012] 本发明所述的步骤（1)、步骤（2)和步骤（3)之间的顺序不限，可以是先步骤（1)， 然后步骤（2)，最后步骤（3);或者是，先步骤（1)，然后步骤（3)，最后步骤（2);或者是，先 步骤（2)，然后步骤（1)，最后步骤（3);或者是，先步骤（2)，然后步骤（3)，最后步骤（1);或 者是，先步骤（3)，然后步骤（1)，最后步骤（2);或者是，先步骤（3)，然后步骤（2)，最后步 骤⑴。
[0013] 所述的新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖可以是以本领域常规方法获得的新 红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖，优选是将新红细胞生成刺激蛋白依次通过化学还原 和肽Ν-糖苷酶F酶切而释放的Ν-连接寡糖。
[0014]所述的广谱性的唾液酸酶α(2-3, 6, 8, 9)-specificNeuraminidase，又叫 α(2-3, 6, 8, 9)Neuraminidase、Acyl-neuraminylHydrolase、Sialidase、Arthrobacter ureafacienssialidase或NANaseIII，其可同时酶切a(2-3)、a(2-6)、a(2-8)及 a(2-9)连接的糖苷键。所述的广谱性的唾液酸酶a(2-3, 6, 8, 9)-specificNeuraminidase 一般来自Arthrobacterureafaciens。
[0015]所述的特异性的唾液酸酶α(2-3)-specificNeuraminidase，又叫α(2-3) Neuraminidase或NANaseI，其可仅酶切α(2-3)连接的糖苷键，而不能酶切α(2-6)、 α(2-8)及α(2-9)连接的糖苷键。所述的特异性的唾液酸酶α(2-3)-specific Neuraminidase一般来自重组基因后的Streptococcuspneumoniae。
[0016] 所述的化学还原在进行前，优选先进行前处理来去除糖蛋白样品中的盐以及表面 活性剂。所述的去除糖蛋白样品中的盐以及表面活性剂的方法可为本领域各种常规的去除 糖蛋白样品中的盐以及表面活性剂的方法，优选采用超滤离心的方法。所述的超滤离心所 用的超滤管优选为体积1. 5mL，滤膜孔径大小3000Da，滤膜的膜材质为苯乙烯与丁二烯的 共聚物。所述的超滤离心的离心力条件优选为10000~14000g。所述的超滤离心的一次离 心的时间优选为10~15min。所述的超滤离心的次数优选为3~4次，且每次离心前将样 品用水稀释。所述的超滤离心在结束后，优选将超滤管倒置，1000~3000g离心力条件下离 心3~5min回收蛋白。
[0017] 所述的化学还原的方法为本领域常规的糖蛋白的化学还原的方法，优选包括以 下步骤：将含有新红细胞生成刺激蛋白、二硫苏糖醇的pH为8. 0的水溶液依次置于95~ 100°C和20~25°C的温度下分别保持20~30s，将得到的产物再重复以上"依次置于95~ 100°C和20~25°C的温度下分别保持20~30s"的操作5次。所述的二硫苏糖醇的浓度优 选为5~20mM。所述的新红细胞生成刺激蛋白的用量优选为反应体系中237. 5~950g新 红细胞生成刺激蛋白/mol二硫苏糖醇。所述的pH为8. 0的水溶液优选使用碳酸铵水溶液 调节pH值至8.0。
[0018] 所述的肽N-糖苷酶F酶切中，肽N-糖苷酶F和新红细胞生成刺激蛋白的用量比 例优选为每95~100μg新红细胞生成刺激蛋白用1000U(活力单位）的肽N-糖苷酶F进 行酶切。所述的肽N-糖苷酶F酶切的温度优选为35~38°C，更优选为37°C。所述的肽 N-糖苷酶F酶切的时间优选为16~18h。所述的肽N-糖苷酶F酶切在进行完后，优选进 行以下后处理步骤：将肽N-糖苷酶F酶切后的体系与冰冻乙醇混合，10000~14000g离心 力条件下离心8~lOmin，取上清液冻干备用。所述的冰冻乙醇的体积优选为是所述的酶切 的体系的体积的3~4倍。
[0019] 所述的8-氨基芘-1，3, 6-三磺酸三钠盐荧光衍生（APTS荧光衍生）的