管电泳分 离，结果见图1。以甘露二糖为内标，是为了校正迁移时间，增加色谱峰迁移时间和葡萄糖单 元组成个数的线性关系的准确性。
[0080] 将图1中各组分的色谱峰迁移时间和葡萄糖单元组成个数（GU值）进行相关性分 析，结果如图2,线性良好，线性相关系数的平方R2 = 0. 998。根据图2中的线性关系，可以 实现将新红细胞生成刺激蛋白经肽N-糖苷酶F酶切产物中所有N-连接寡糖或衍生后的 N-连接寡糖的电泳迁移时间转换为葡萄糖单元组成个数（⑶)。
[0081] 依次按照实施例1、2、3、4、6、9的方法进行操作，具体地说是，将新红细胞生成刺 激蛋白经肽N-糖苷酶F酶切，酶切后的N-连接寡糖经APTS荧光衍生后的产物电泳分离图 见图3。⑶值范围约4-10。
[0082] 依次按照实施例1、2、3、4、6、10和9的方法进行操作，其中实施例10中的糖苷外 切酶包括广谱性的唾液酸酶ct(2-3, 6, 8, 9)-specificNeuraminidase酶切和特异性的唾 液酸酶α(2-3)-specificNeuraminidase酶切，具体地说是，将APTS荧光衍生后的新红细 胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖分为两部分，第一部分用光谱性的唾液酸酶进行酶切，第 二部分用特异性的唾液酸酶Ct(2-3)-specificNeuraminidase进行酶切，每种唾液酸酶 酶切后的产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离结果见图4,其中图a是广谱性的唾液酸酶 α(2-3, 6, 8, 9)_specificNeuraminidase酶切产物的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，图 b是特异性的唾液酸酶a(2-3)_specificNeuraminidase酶切产物的激光诱导突光毛细 管电泳分离图。广谱的唾液酸酶同时酶切α-2, 3/6/8连接的唾液酸，特异性的唾液酸酶 a(2-3)-specificNeuraminidase只可以酶切α-2, 3连接的唾液酸，它们酶解产物的分离 电泳图色谱峰完全一致，说明了其所有末端唾液酸的连接方式是α-2, 3连接。
[0083] 依次按照实施例1、2、3、4、6、10、11和9的方法进行操作，具体地说是，将 APTS荧光衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖先用广谱性的唾液酸酶 α(2-3, 6,8, 9)_specificNeuraminidase酶切，酶切后的产物分为四部分，第一部分直接用 激光诱导荧光毛细管电泳分离；第二部分先用β1-4半乳糖苷酶酶切，然后酶切后产物再 用激光诱导荧光毛细管电泳分离；第三部分先用β1-4半乳糖苷酶和β-Ν-乙酰氨基葡糖 苷酶的混合酶进行酶切，然后酶切后产物再用激光诱导荧光毛细管电泳分离；第四部分先 用β1-4半乳糖苷酶、β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶的混合酶进行酶切，然后酶切 后产物再用激光诱导荧光毛细管电泳分离。结果见图5,其中图a为新红细胞生成刺激蛋白 的去唾液酸化N-连接寡糖的激光诱导荧光毛细管电泳分离图，图b是β1-4半乳糖苷酶对 新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化Ν-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图，图c是同时进 行β1-4半乳糖苷酶以及β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化 Ν-连接寡糖酶切后产物的电泳分离图，图d是同时进行β1-4半乳糖苷酶、β-Ν-乙酰氨基 葡糖苷酶和岩藻糖苷酶对新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化Ν-连接寡糖酶切后产物的 电泳分离图。
[0084] 图5中的图b与图a相比，所有的色谱峰迁移时间提前，说明所有糖链末端都连 接有半乳糖，其连接方式是β1-4连接。图5中的图c中只出现了色谱峰2,推算其GU= 6. 21，推断其为核心岩藻糖化的甘露五糖。对其进行验证，在此基础上，又加入了岩藻糖苷 酶进行酶切产物的电泳分离如图5中的图d。图5中图c的色谱峰2对应迁移成为图5中 图d的色谱峰1，GU值变化了 0. 84。说明所有N-连接寡糖都是核心岩藻糖化。岩藻糖化 五糖核心单元的结构式见表1,五糖核心单元的结构式也见表1。
[0085] 图5中图a中的占N-连接寡糖色谱峰面积95 % (归一化法计算）的糖链去唾液 酸化后的结构都已推导出，结构式见表1。表1中峰号为3~9对应图5中图a中各个标记 了相应峰号的色谱峰。
[0086] 表1、新红细胞生成刺激蛋白N-连接寡糖的结构式及结构单元
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091] 依次按照实施例1、2、3、5、6、7和8的方法进行操作，具体地说是，将新红细胞生成 刺激蛋白经肽N-内切酶酶切后的产物N-连接寡糖经2-AB衍生后，由弱阴离子交换色谱分 离后的色谱结果见图6,图6中"+1唾液酸"表示末端有一个唾液酸的N-连接寡糖的色谱 峰，"+2唾液酸"表示末端有两个唾液酸的N-连接寡糖的色谱峰，"+3唾液酸"与"+4唾液 酸"同理。对图6中不同唾液酸化程度的N-连接寡糖进行了定量分析（归一化法），结果 如图7所示。单唾液酸化的N-连接寡糖的含量是2. 3%，二唾液酸化的N-连接寡糖的含量 是9. 3 %，三唾液酸化的N-连接寡糖的含量是23. 8 %，四唾液酸化的N-连接寡糖的含量是 64. 7%。
[0092] 由于中性的N-连接寡糖和单唾液酸化的N-连接寡糖含量小于5%，主要制备收 集二唾液酸化、三唾液酸化以及四唾液酸化的N-连接寡糖，依次按照实施例1、2、3、7和8 的方法进行收集。对制备收集的二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖以 及四唾液酸化的N-连接寡糖分别经脱盐后，分别都均分为两部分，每种N-连接寡糖的其中 一部分都分别依次按照实施例4、6和9的方法进行APTS荧光衍生后用激光诱导荧光毛细 管电泳进行分离。二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡糖、四唾液酸化的N-连接寡糖电泳分离结果分别如图8中a-l、b-l以及c-1所示。每种N-连接寡糖的另一 部分都分别依次按照实施例4、6、10和9的方法进行APTS荧光衍生后唾液酸酶酶切，最后 用激光诱导荧光毛细管电泳进行分离，这里实施例10中的糖苷外切酶为特异性的唾液酸 酶a(2-3)_specificNeuraminidase。二唾液酸化的N-连接寡糖、三唾液酸化的N-连接寡 糖和四唾液酸化的N-连接寡糖，它们的去唾液酸化产物的电泳分离结果分别如图8中的 a-2、b-2以及c-2所不。
[0093] 本发明中根据图5的结果已经对电泳图中新红细胞生成刺激蛋白的去唾液酸化 N-连接寡糖的结构进行了归属，现在根据图8的结果又知道了N-连接寡糖的唾液酸化程 度，最终确定了占总的N-连接寡糖含量95%的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的结 构，如表1所示，表1中峰号为10~18对应图3中各个标记了相应峰号的色谱峰。新红细 胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖中，中性的N-连接寡糖及单唾液酸化的N-连接寡糖由于含 量太少，其结构没有进行鉴定。
[0094] 综上所述，本发明的方法利用了激光诱导荧光毛细管电泳（CE-LIF)和弱阴离子 交换色谱的二维分离技术，大大提高了可被检测到的糖链类型数。同时二维分离技术与糖 苷外切酶测序技术（Exglycosidasesequencing)相结合，可以快速、高效、准确地实现新红 细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构的鉴定。而且方法简单，灵敏度高，检出限低于A摩 尔数量级。本发明中对新红细胞生成刺激蛋白上的N-连接寡糖结构中占质量分数95%的 糖链都进行了结构鉴定。
[0095] 本发明所鉴定的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的结构与文献 (Proteomics2007, 7, 4278-4291及AnalyticalBiochemistry2008, 383, 243-254)报道的 重组的促红细胞生成素的N-连接寡糖的结构相比，具有很大的相似性。N-连接寡糖都存在 复杂型糖链，不存在高甘露糖型以及杂合型的糖链。
[0096] 本发明所鉴定的新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖的组成单糖的连接方式及 含量也是与文献（Anal.chem. 2011，83, 4154-4162)报道一致的。末端唾液酸都是α2-3连 接的糖苷键、半乳糖都是β1-4连接的糖苷键以及岩藻糖都是α1-6连接的糖苷键。不同 唾液酸化糖链的相对含量都是四唾液酸化的Ν-连接寡糖的含量〉三唾液酸化的Ν-连接寡 糖的含量〉二唾液酸化的Ν-连接寡糖的含量〉单唾液酸化的Ν-连接寡糖的含量。
[0097] 与这些现有技术相比，本发明首次将毛细管电泳的检测方法用在了新红细胞生成 刺激蛋白的Ν-连接寡糖的结构分析上。毛细管电泳的分析方法灵敏度高，可以对浓度很低 的新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖的样品进行检测，这同时也节约了成本，且毛细管 电泳的分析方法分离度高，可实现单个组分的Ν-连接寡糖的基线分离。另外，毛细管电泳 的分析方法用在新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖的结构分析时操作简便，如果采用 毛细管阵列电泳的仪器设备，则可实现本发明的方法的高通量的实施，利于工业化应用。这 些优势都是现有技术中的液相色谱分析方法或质谱分析方法应用在新红细胞生成刺激蛋 白的Ν-连接寡糖的结构分析时所不具备的。
【主权项】
1. 一种新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖结构鉴定的方法，其特征在于，其包括以 下步骤： (1) 对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1，3, 6-三磺酸三钠 盐荧光衍生，衍生产物分为两部分，一部分用广谱性的唾液酸酶ct(2-3, 6, 8, 9)-specific Neuraminidase进行酶切，另一部分用特异性的唾液酸酶α(2-3)-specificNeuraminidase 进行酶切，对每一部分的酶切产物分别通过激光诱导荧光毛细管电泳进行分离；从毛细管 电泳的结果来确定新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖上末端唾液酸与N-连接寡糖上唾 液酸以外的部分的连接方式； (2) 对新红细胞生成刺激蛋白的N-连接寡糖进行8-氨基芘-1，3, 6-三磺酸三钠盐荧 光衍生，然后用特异性的唾液酸酶ct(2-3)-specificNeuraminidase或广谱性的唾液酸酶 α(2-3, 6, 8, 9)-specificNeuraminidase进行酶切使去唾液酸化，形成中性的N-连接寡 糖；然后将中性的N-连接寡糖分为三部分，第一部分用β1-4半乳糖苷酶进行酶切，第二 部分用β1-4半乳糖苷酶和β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶进行酶切，第三部分用β1-4半乳糖 苷酶、β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶和岩藻糖苷酶进行酶切；对每一部分的酶切产物分别用激 光诱导荧光毛细管电泳分离；然后分别将每一部分的分离结果中的色谱峰迁移时间转换为 葡萄糖单元组成个数；然后结合每一部分所用的糖苷外切酶的特异性，归属所述的中性的 Ν-连接寡糖的结构； (3) 将新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖分为两部分，即第一部分和第二部分；将 第一部分先进行2-氨基苯甲酰胺衍生，然后用弱阴离子交换色谱法对衍生后的产物进行 梯度分离，使衍生后的新红细胞生成刺激蛋白的Ν-连接寡糖中的中性的Ν-连接寡糖、单 唾液酸化的Ν-连接寡糖、二唾液酸化的Ν-连接寡糖、三唾液酸化的Ν-连接寡糖及四唾液 酸化的Ν-连接寡糖达到基线分离；第二部分不经2-氨基苯甲酰胺衍生，直接用弱阴离子 交换色谱法进行梯度分离，且梯度分离的条件同第一部分的梯度分离条件相同，并按照第 一部分的分离结果中的衍生后的二唾液酸化的Ν-连接寡糖、衍生后的三唾液酸化的Ν-连 接寡糖及衍生后的四唾液酸化的Ν-连接寡糖的出峰时间分别对第二部分的梯度分离后 的未经衍生的二唾液酸化的Ν-连接寡糖、未经衍生的三唾液酸化的Ν-连接寡糖及未经 衍生的四唾液酸化的Ν-连接寡糖进行收集；对收集的这三种Ν-连接寡糖都分别进行以 下操作：先脱盐，然后用8-氨基芘-1，3, 6-三磺酸三钠盐进行荧光衍生，然后将8-氨基 芘-1，3, 6-三磺酸三钠盐衍生产物分为两部分，一部分直接进行激光诱导荧光毛细管电泳 分离，另一部分先用特异性的唾液酸酶α