线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用
【专利说明】线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑制脂质累积的药物 靶标的应用
[0001] 本申请是中国发明专利申请"准确快速实现表型筛选所获得活性化合物药物靶点 鉴定的方法"（【申请号】201410377168. 4,申请日2014-08-01)的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及医药领域，更具体地讲，涉及线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑 制脂质累积的药物靶标的应用。
【背景技术】
[0003] 药物发现策略主要包括"基于表型的筛选（phenotypic screening) "和"基于革巴点 的筛选（target-based screening) "。这两大类型的药物筛选已经相继主导过去一百年的 药物开发。前者关注化合物诱导的细胞、组织或整个生物体的效应或表型，而后者在体外分 析化合物对纯化的靶蛋白的效应。其中，基于靶点的药物筛选在近30年占主导地位。然而， 1999年到2008年FDA批准的新药统计分析表明：基于靶点的筛选尽管在follower跟踪类 药物的审批中占有优势，但是在first-in-class原创新药的发现上只有17个，而非主流技 术"基于表型的筛选" ：first-in-class却有28个。基于表型的筛选在first-in-class原 创新药开发中具有明显优势。学术界和产业界开始质疑基于靶标的筛选虽然有其优势，但 也可能限制了药物发现的范围。而基于表型的筛选在药物发现中正卷土重来，并激起了激 烈的争议。诺华和葛兰素史克公司是积极拥抱这种回潮的拥趸者，而罗氏和基因技术公司 似乎对此疑虑重重。值得注意的是，无论是学术界还是产业界，无论是赞成基于表型筛选的 诺华和葛兰素，还是反对者罗氏和基因技术公司（Genentech)，都源自基于表型筛选获得活 性化合物后如何实现靶标鉴定这一问题。活性化合物的发现与靶标的鉴定两者间实现无缝 对接是学术界和产业界关注的焦点和难点。靶标的鉴定的新技术已经成为能否让基于表型 的筛选重新受到学术界和产业界的青睐，夺回被基于靶标的筛选侵占的主导地位的关键， 推动药物研发革命的关键。
[0004] 目前，基于表型的药物筛选包括基于细胞、组织表型的筛选以及基于动物表型的 筛选。基于细胞表型分析通常使用原代人类细胞株，永生化细胞系（原代或工程化），或来 自患者或正常人类原代细胞，以及被诱导的多能干细胞（iPSCs)分化的特定细胞类型等。 与基于靶标的药物筛选相比，基于细胞表型分析的药物筛选是处于复杂的蛋白相互作用和 信号网络的生物环境，更接近于人体，是目前药物表型筛选的主流。但是，其缺点是细胞不 能模拟人体的药物吸收、分布、代谢和排泄过程，以及体内的毒性。导致很多体外有生物学 效应的化合物在体内效应不一致。
[0005] 与细胞相比，基于动物模型的筛选除了对疾病的疗效数据，给予小动物的表型筛 选可提供对化合物吸收，分布，代谢和毒性丰富的信息。啮齿类动物，如小鼠、猴子等，与人 类种属之间的保守型高，但是其成本高、操作复杂、周期长，不适合初期的药物筛选。在过去 10 - 20年，很多疾病都找到了合适的与人类疾病相关性好小动物疾病模型，包括秀丽隐杆 线虫，斑马鱼，非洲爪蟾和果蝇等，这些小动物体积小、好饲养、生命周期短，适合高通量的 药物筛选，已经被成功应用于很多疾病相关的活性化合物筛选。无论是基于细胞的筛选以 及基于动物模型的筛选，两者均受困于靶点鉴定。只有找到药物的靶点分子才能理解药物 与靶点结构互作的本质；才可以针对性的开发、设计、优化和改造化合物；同时，也有利于 药物的临床实验设计，选择合适的人群，增加药物研发的可预测性，降低药物研发的费用。
[0006] 目前已知的药物靶点98%以上属于蛋白质，包括G蛋白耦联受体、丝氨酸、苏氨 酸和酪氨酸蛋白激酶、锌金属肽酶、丝氨酸蛋白酶、核激素受体以及磷酸二酯酶等。尽管以 RNAi为代表的遗传学手段在药物靶点的鉴定方面有一些成功的案例，蛋白质芯片、同位素 标记的策略以及化学蛋白质组学等从蛋白质角度鉴定药物靶点才是最直接有效的策略。其 中，化学蛋白质组学是目前鉴定和发现药物靶点的最有效的手段。化学蛋白质组学以活性 化合物为饵钓取相互作用的蛋白质，并结合质谱定性定量分析，发现药物靶点。值得注意的 是，当药物与靶点蛋白是共价键结合时，通过苛刻的冲洗，可以显著减少非特异性结合蛋白 质。但小分子化合物与蛋白质常常呈非共价键形式相互作用，为了保证靶点蛋白的结合，不 能采用剧烈的冲洗，会残留很多非特性结合的蛋白质，需要艰巨的去伪存真的工作，这是困 扰化学蛋白质组学与表型筛选对接的关键。
[0007] RNAi能够非常快速地使靶基因失活，从而很快成为基因功能研究和靶标验证的重 要工具。然而在哺乳动物细胞中进行大规模的RNAi是有困难的。Timmons和Fire首次描 述了通过喂食表达dsRNA的细菌给线虫可达到RNAi的目的，该技术（feeding RNAi)操作 方便，很快成为一种有效的筛选目的基因功能缺失型的重要工具，为快速筛选化合物的潜 在靶蛋白提供了可能。
[0008] 秀丽线虫（Caenorhabditis elegans)虫体小、透明，生命周期较短、繁殖快，便于 表型观察；实验无需特殊条件、无菌要求低、不易交叉污染、便于操作及长期保藏；秀丽线 虫具有2000个基因，是最早完成测序的生物体，约60%的基因与人类同源；在线虫中基因 沉默、过表达、敲除及突变的技术非常成熟；CGC等线虫保藏中心拥有大量突变体线虫，另 外还拥有丰富的WormBook、WormBase等免费网络资源提供线虫的基本知识、实验技术和基 因信息。线虫虽小，只有1000个细胞，却已经具备分化的细胞和器官，可以表现出衰老、行 为、认知和疾病等多细胞生物的复杂表型。同时，与细胞相比较，秀丽线虫在化合物筛选方 面还得益于对化合物具有吸收、代谢、分部、排泄等药物代谢动力学的完整过程势，其获得 的活性小分子化合物与人体实验更接近。秀丽线虫的复杂性正好适合于化合物的表性分 析。近年来在抗衰老、脂肪储存和代谢、抗细菌和真菌感染、糖尿病、及神经退行性病变等领 域均有深入的研究，建立了高效的筛选模型，并获得了一些重要的活性化合物。我们利用秀 丽线虫和化学蛋白质组学可以实现两者的无缝对接，解决目前制约first-in-class原创 药物发现的瓶颈和基础性问题。
[0009] 番蒸枝内酯（Annonaceous acetogenins)是从番蒸枝科植物中分离得到的一类具 有广谱生理活性的天然化合物。申请人的发明专利申请番荔枝内酯聚醚类似物AA005及其 结构类似物在制药中的应用（【申请号】201310143100. 5)已经揭示了番荔枝内酯聚醚类似 物AA005及其结构类似物在制备预防或治疗脂质代谢异常疾病药物中的应用。我们在研究 中意外发现该化合物类似物可以阻断秀丽线虫及小鼠前脂肪细胞3T3-L1脂质累积，但其 作用靶标未知。本发明主要以该化合物为探针，探讨化学蛋白质组学结合秀丽线虫feeding RNAi鉴定药物靶标的新方法。这种策略的成功实施可能为解决目前药物候选蛋白从发现到 确证的瓶颈提供可能。
【发明内容】
[0010] 本发明的第一个目的在于，提供线粒体三功能酶α亚基在制备番荔枝内酯聚醚 类似物ΑΑ005抑制脂质累积的药物靶标的应用。
[0011] 本发明第二个目的在于，提供线粒体三功能酶α亚基作为药物靶标在筛选调控 脂质代谢的小分子化合物中的应用。
[0012] 为实现本发明第一个发明目的，本发明公开以下技术方案：线粒体三功能酶α亚 基在制备番荔枝内酯聚醚类似物ΑΑ005抑制脂质累积的药