因沉默表达后能够明显延迟线虫的发育。将同步化至L1期线 虫，分别喂食含对应8种基因RNAi质粒的菌，记录其自然发育到L4期的时间。
[0031] 图7显示与Biotin-AA005相互作用的蛋白对应线虫的所有同源基因功能被抑制 后镜下观察线虫整体形态。其中有8种基因包括rpl-5、rla-0、hsp-6、H28016. 1、atp-2、 act-4、act-3和act-1 (红色框标出）经过RNAi干扰48h后线虫体长明显减小。
[0032] 图8中，图8A显示基因T08B2. 7沉默表达后线虫体脂明显减少。构建了分别针对 基因T08B2. 7的N端（T08B2. 7-N)和C端（T08B2. 7-C)的RNAi质粒，给L1期线虫喂食，48h 后油红0染色，镜下观察线虫体脂累积情况；图8B显示针对基因T08B2. 7的N端或C端的两 种质粒均沉默T08B2. 7的mRNA水平；图8C显示基因T08B2. 7沉默表达后，不影响线虫的发 育情况；图8D显示基因T08B2. 7沉默表达后，不影响线虫的存活力；图8E显示基因T08B2. 7 沉默表达后，不影响线虫的身体弯曲次数，反映线虫运动力良好；图8F显示基因T08B2. 7沉 默表达后，不影响线虫的摆头次数，反映线虫运动力良好；图8G显示基因T08B2. 7沉默表达 后，不影响线虫吞咽球的收缩次数，反映线虫的进食情况良好；图8H显示基因T08B2. 7沉默 表达后，不影响线虫的生殖能力。
[0033] 图9中，图9A显示针对HADHA的敲除片段均能沉默其在3T3-L1细胞中的表达；图 9B显示沉默HADHA蛋白表达后3T3-L1细胞中的脂质累积明显减少。构建了针对基因hadha的RNAi质粒，转染3T3-L1细胞，油红0染色，镜下观察细胞脂质累积情况；图9C显示5倍和 10倍AA005能够阻断Biotin-AA005与蛋白HADHA的特异性结合。Biotin-AA005及加入5倍 和10倍AA005竞争组，在体外分别与3T3-L1细胞裂解液孵育，通过str印tavidin-agarose beads钓取与Biotin-AA005相互作用的蛋白，单独Biotin组作为对照，Input作为细胞裂 解液全蛋白对照，Western Blot检测各组蛋白中HADHA的情况。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0035] 实施例1. AA005及其结构类似物能够在无毒性情况下特异性抑制线虫体脂累积
[0036] 同步化后的L1期N2线虫，在NGM板上0P50菌饲养28h后，将线虫均分入六孔板 中，分别用4μΜ的AA005、A1、A2、A3化合物处理线虫14h，对照组不加药物，并适当的0P50 菌饲养。药物处理后的各组线虫，分别放在含有0P50菌的NGM板上恢复16h，收取等量线虫 油红0染色以及萃取油红0定量，观察AA005及其衍生物对线虫脂质累积情况的影响。镜 下观察（图1C)，与对照组相比，化合物AA005和A3处理后的线虫体内脂质明显减少，而化 合物A1和A2的脂质几乎不变。染色后分别取对照组和实验组线虫100条，加入100%的异 丙醇萃取线虫体内油红〇, 37°C静置2h，分光光度计检测各组吸收峰，统计定量结果也显示 只有化合物AA005和A3处理后的线虫体内脂质明显减少。为了排除AA005对线虫产生毒 性效应以致线虫存活力下降而导致体脂减少，同时检测了该浓度的AA005处理后线虫的各 项基本生命指标，表明线虫存活力良好（图2)。将同步化后L1期N2线虫在NGM板上0P50 菌饲养28h后，不加药组和4 μ M-AA005组分别处理线虫14h，镜下观察每组线虫整体表型， 计算平均体长（图2A);计算每组内L4期线虫数目所占线虫总数的比例和未发育到L4期 线虫数目所占线虫总数的比例，测定两组线虫的发育情况（图2B);计算每组线虫的存活 率，作为药物处理后线虫的存活率（图2C);将线虫置于空板上，lmin后待线虫适应环境后， 记录20s内两组线虫运动时的身体弯曲次数（η = 10)(图2D);记录线虫lmin内两组线虫 的摆头次数（η = 10)(图2E)，作为药物处理后线虫运动情况的测定；记录10s内两组线虫 的吞咽球收缩次数（η = 10)(图2F)，测定线虫的进食能力；继续培养，记录两组L4期线虫 从产卵开始24h内板子上的虫卵以及孵化幼虫的总数（η = 12)，测定线虫的产卵情况（图 2G)。综合以上结果表明，化合物ΑΑ005在无细胞毒性的情况下具有特异性抑制线虫体脂的 表型。
[0037] 实施例2. ΑΑ005及其结构类似物能够特异性抑制前脂肪细胞3T3-L1中甘油三酯 的累积
[0038] 3T3-L1细胞连续生长至完全接触抑制两天后，加入MDI三联药至含10%胎牛血清 的DMEM高糖培养基中诱导分化，处理组细胞加入300ηΜ的ΑΑ005及结构类似物Α1、Α2、Α3， 将诱导分化8天的对照组与四种化合物处理组细胞油红0染色后，进行大体观及镜下拍照 (图3Α)，萃取细胞中油红0染料，分光光度计定量。结果提示与对照组相比，ΑΑ005处理组 与A3处理组细胞中油红0染色减少，并且AA005的抑制效应最为显著，而A1和A2处理组 细胞中油红〇染色不变。加入不同浓度的AA005处理，将诱导分化8天的对照组与AA005 处理组细胞油红0染色后，进行大体观及镜下拍照（图3B)，结果提示与对照组相比，AA005 处理组细胞中油红0染色减少，并且随着AA005处理浓度的升高，油红0染色减少越明显。 当然为排除AA005对细胞产生毒性效应以致细胞死亡而油红0染色减少，同时用CCK-8试 剂盒检测表明该浓度的AA005处理组细胞活力良好，与对照组细胞无明显差异。这些结果 提示AA005能够在无细胞毒性条件下特异性抑制前脂肪细胞3T3-L1中甘油三酯的累积。
[0039] 实施例3.化学蛋白质组学钓取AA005的相互作用蛋白质
[0040] 为了利用亲和层析获得AA005相互作用的蛋白，我们在其活性中心以外连接了 Biotin构建了生物素标记的AA005 (Biotin-AA005)(图4A)。修饰后的小分子依然保持了 AA005抑制3T3-L1细胞脂质累积的生物学活性，能够显著抑制细胞内脂滴的形成（图4B)。 我们又通过Mito-tracker标记线粒体和FITC标记的链霉亲和素共染的免疫荧光染色实验 来分析Biotin-AA005在3T3-L1细胞内的定位，结果表明Biotin-AA005几乎全部定位于线 粒体内（图4C)。据此，我们推测AA005的相互作用蛋白很可能定位于线粒体中。接下来， 利用差速离心联合不连续密度梯度离心方法分离纯化3T3-L1细胞线粒体、细胞核以及细 胞浆组分。同时用各细胞器的标志蛋白通过免疫印迹法评价各细胞器的纯化程度，结果表 明各细胞器的纯化情况良好（图4D)。在此基础上，各细胞器裂解液上清与Biotin-AA005 进行体外孵育，用亲和素的磁珠pull-down与之相互作用的组分，用SDS-PAGE胶分离并用 考马斯亮蓝染色。结果与我们的推测一致，与Biotin-AA005相互作用的蛋白条带主要产生 在线粒体组分，并且这些条带在单独的Biotin孵育组中并没有出现（图4E)。我们接下来 将这些差异蛋白条带切胶然后进行LC-MS质谱分析。质谱鉴定结果显示Biotin-AA005共 分离得到候选蛋白30种（图5)。