图2。
[0070] 1.2. 2提取溶剂的选择
[0071] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g，分别加水、30%甲醇溶液、50%甲醇溶 液、70%甲醇溶液、甲醇25血，超声处理30min，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得。
[0072] 由图3显示，50%甲醇与70%甲醇溶液提取样品得到谱峰信息较全且相似，从经 济及环境污染的角度考虑，最终选取50%甲醇做为供试品溶液制备的提取溶剂。
[0073] 1. 2. 3提取剂用量的选择
[0074] 取坤灵丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g，分别加入50 %甲醇10ml、15ml、20ml、 25ml，超声处理30min，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得。比较不同用量的提取剂对色谱峰个 数及峰面积的影响，见图4。由图可W看出，提取剂用量并不影响色谱峰的个数，但除保留时 间42min左右的大峰的外其余色谱峰均较小，故考虑选择提取剂用量为10ml。
[00巧]1. 2. 4流动相系统的选择
[0076] 进行上述试验考察时，采用甲醇-水流动相体系，色谱柱使用一段时间后色谱柱 柱压升高明显，且色谱图中个别色谱峰峰形明显变差，故考察了己腊-水流动相体系、己 腊-0. 1%甲酸水流动相体系、己腊-0. 1%磯酸流动相体系。试验过程中，采用线性梯度洗 脱分离坤灵丸中的有效成分。结果表明，当流动相为己腊-0. 1%磯酸、己腊-水时，不能将 31分钟处的色谱峰分开，故最终选择流动相体系为：己腊-0. 1 %甲酸水溶液。
[0077] 1. 2. 4流动相梯度洗脱程序的选择
[0078] 选择比较了约20种不同洗脱梯度对坤灵丸指纹图谱色谱峰的影响，最终确定梯 度洗脱条件如表1所示：
[0079] 1. 3分析方法的确定
[0080] 综上分析，最终确定坤灵丸指纹图谱分析方法如下：
[0081] 取坤灵丸适量，糖衣丸除去糖衣，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加 50%甲醇适量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续 滤液即得。W十八烷基键合硅胶为填充剂；W己腊-1 %甲酸为流动相，梯度洗脱，见表2-3 ; 流速1. 0ml/分钟；柱温3(TC ;检测波长；274皿。
[0082] 1. 4化学成分定性研究及参照峰的选择
[0083] 为进一步明确坤灵丸中所含成分，采用对照品保留时间对比法暂定坤灵丸中可能 含有的化学成分。通过查阅文献，坤灵丸中可能含有的成分为丹皮酪、α-香附丽、松果菊 巧、和厚朴酪、延胡索己素、厚朴酪、山奈素、梓醇、甘草酸倭、k脯氨酸、黄茂甲巧、人参皂巧 Rf、人参皂巧Re、人参皂巧Rgl、盐酸益母草碱等。通过对比样品与对照品之间的保留时间 发现，在该色谱条件下，在样品中可W定位的化学成分有丹皮酪、松果菊巧，色谱图中丹皮 酪的含量最高，且为产品中含量测定项的指标成分，故选择丹皮酪为参照峰。详见图6。
[0084] 1. 5指纹图谱试验的方法学验证
[0085] 1. 5. 1精密度实验
[0086] 取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120903)0. 5g，精密称定，按 "1. 3"项下液相指纹分析方法，连续进样6针，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。W参 照物丹皮酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比 值。
[0087] 结果见表4、5。
[0088]
[0089]
[0090] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~2. 76%范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0.00%~0.25%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，结果显示 方法的精密度较好。
[0091] 1.5. 2重复性实验
[009引取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120901)0. 5g，各六份，精密 称定，按"1. 3"项下液相指纹测定方法测定，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积。W参 照物丹皮酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比 值。结果见表6、7。
[0093]
[0094]
[0095] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~2. 39%范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0. 00%~0. 40%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，该方法的 重复性较好。
[009引 1. 5. 3稳定性实验
[0097] 取坤灵丸样品（薄膜衣批号：20121002 ;糖衣批号：20120903)0. 5g，精密称定，按 "1. 3"项下液相指纹测定方法，分别于0、1、2、4、6、8、16、24小时，测定一次，W参照物丹皮 酪的保留时间和峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间与相对峰面积比值。结果 见表8、9。
[0098]
[0099] 结果显示；8个共有峰面积比值相对标准偏差在0. 00%~5. 51 %范围内，保留时 间比值相对标准偏差在0. 00%~0. 55%范围内。符合指纹图谱技术标准的要求，该方法的 重复性较好。
[0100] 2.1指纹图谱方法分析
[0101] 2. 1. 1指纹图谱共有峰的确定
[0102] 选取坤灵丸薄膜衣丸7批、糖衣丸5批，按"1. 3"项下液相指纹测定方法分别测定， 根据12批坤灵丸供试品HPLC图谱所给出的相关参数，有8个色谱峰是各批共有的，见图7、 图8。
[0103] 另将12批样品中8个共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析，W 6号峰 丹皮酪为参照峰，计算其它7个共有峰的相对保留时间及峰面积比值，则11批样品的共 有峰平均相对保留时间（峰号）依次为；0. 08(1)、0. 13似、0. 14(3)、0. 57(4)、0. 79巧）、 1.00化）、1.08(7)、1.13(8)，其相对偏差均在±10%^内。见表10、11。
[0104] 表10 11批样品共有峰相对保留时间
[0105]
[010 引
[0109] 2. 1. 2对照指纹图谱的拟合
[0110] W上述12批样品的指纹图谱中8个峰为共有峰，利用中药色谱指纹图谱相似度评 价系统（2. 0版），拟合确定坤灵丸对照指纹图谱，见图9。
[0111] 2. 1.3指纹图谱的标准限定
[0112] 因目前迂宁天±力生产的产品批数较少，后续还需大量样品的质量跟踪，数据积 累，初步暂定坤灵丸的指纹图谱相似度在0. 90 W上为合格。
[0113] 本发明的有益效果在于：
[0114] 本发明通过尝试多种不同洗脱条件，最终确定了坤灵丸的指纹图谱分析的色谱条 件，考察确定了 8个共有峰的对照指纹图谱，方法简便、快速、重复性好，经方法学验证满足 相关要求。
[0115] 本发明建立的一种坤灵丸的指纹图谱分析方法适用性强，能够更全面反映产品的 质量状况。
【附图说明】
[0116] 图1坤灵丸200-400nm全波长扫描色谱图
[0117] 图2 274皿波长图谱图
[0118] 图3不同提取溶剂比较色谱图
[0119] 图4不同提取溶剂比较色谱图
[0120] 图5不同流动相体系比较色谱图
[0121] 图6化学成分定性比较色谱
[0122] 图7 11批坤灵丸样品的液相重叠图
[0123] 图8 11批坤灵丸样品的共有峰匹配图
[0124] 图9由12批坤灵丸样品拟合的对照指纹图谱
【具体实施方式】：
[0125] W下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0126] 实施例1，坤灵丸的指纹图谱测定
[0127] 取批号为20121102的坤灵丸薄膜衣丸
[0128] 步骤1，供试品溶液的制备
[0129] 取坤灵薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取0. 5g至10ml容量瓶中，加50%甲醇适 量，超声处理30min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。 步骤2,指纹图谱的建立
[0130] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent Z0RBAX(4. 6巧50mm，5um);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为3(TC ;进样量为10μ L，；检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0131] 梯度洗脱表
[0132]
[0133] 按照本发明提供的方法，W坤灵丸建立的HPLC对照指纹图谱为对照，采用中药色 谱指纹图谱相似度评价系统（2. 0版）计算，相似度为0. 989。
[0134] 实施例2,坤灵丸的指纹图谱测定
[0135] 取批号为20121002的坤灵丸薄膜衣丸
[0136] 步骤1，供试品溶液的制备
[0137] 取坤灵薄膜衣丸适量，研成细粉，精密称取0. 4g至10ml容量瓶中，加40%甲醇适 量，超声处理25min，冷却至室温，定容至刻度，摇匀，过0. 45 μ m微孔滤膜，取续滤液即得。 指纹图谱的确定，
[013引步骤2,指纹图谱的建立
[0139] 采用高效液相色谱法，色谱条件为；色谱柱固定相W十八烷基娃焼键合硅胶为填 料，Agilent ZORBAX(4. 6巧50mm，5um);流动相为己腊-1%甲酸水溶液梯度洗脱；流速为 1.0ml/min ;柱温为35°C ;进样量为10 μ L，；检测波长为274nm。在此条件下分析供试品溶 液，得到待测坤灵丸的指纹图谱。
[0140] 梯度洗脱表
[0141]
[0142] 按照本发明提