检测三唑醇的酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测三唑醇的酶联免疫试剂 盒，其特别适于烟叶中三唑醇残留量的检测。
【背景技术】
[0002] 三唑醇(triadimenolCwftsCN^)又名百担，化学名称为1-(4-氯苯氧基)-3,3-二 甲基-1-(1H-1，2,4-三唑-1-基)-2-丁醇，是一种低毒、广谱、高效的内吸性杀菌剂，其主要 作用机理是抑制赤霉素和麦角固醇的生物合成进而影响细胞分裂速率，对烟草根黑腐病、 白粉病、蛙眼病等真菌病害都有很好的防治效果。因此，在我国农业生产中的应用非常广 泛，适用于麦类、玉米、高粱、果蔬、烟草等农作物。
[0003] 烟草中三唑醇残留是国际烟草科学研究合作中心（C0RESTA)密切关注的，且近年 来在我国某些产地烟草中的检出率也较高。随着三唑醇的广泛使用和人们对食品和农作物 安全的重视，三唑醇在食品及农作物中的残留也受到了高度关注。2007年1月欧盟公布了进 口的中国产蜂蜜中检测出三唑醇残留量超标的预警通报。同年5月，日本厚生劳动省查出我 国1批输日胡萝卜中三唑醇残留量超标，由此日方要求对我国出口日本的胡萝卜中三唑醇项 目实施50%监控检查。目前，很多国家已明确限定该农药在食品中的最高残留限量，如日本 规定三唑醇在食品中的残留限量(MRL)为0.2~0.5mg/kg;欧盟规定三唑醇在豆类中的MRL为 0. lmg/kg;国际食品法典委员会(CAC)规定西红柿中三唑醇的MRL为0.5mg/kg。为避免三挫 醇残留对人体造成危害以及突破国外贸易壁皇，建立简单、快速、准确、可靠的烟草中三唑 醇类残留量的检测方法很有必要。
[0004] 目前常用的三唑醇检测方法主要有气相色谱法(GC)、液相色谱法(IX)、气-质联用 法(GC-MS)和液-质联用法(LC-MS)。采用这些分析方法需要昂贵的仪器和专门的技术人员， 样品前处理过程复杂且花费高、费时长，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。酶 联免疫吸附分析法(ELISA)具有简便快速、特异灵敏、样品容量大、分析成本低的特点，可以 简化甚至省去样品净化步骤，在大量样本和现场样本快速筛选检测中显示出独特优势，能 够更好地满足我国企业、政府职能监管部门等开展检测工作，极具发展潜力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种结构简单、使用方便、价格 便宜、便于携带的用于三唑醇残留量检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、 适于大批量样本筛选的定性、定量检测方法。
[0006] 本发明试剂盒，它包括:包被有三唑醇偶联抗原的酶标板、三唑醇单克隆抗体、酶 标记抗抗体、三唑醇标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液;所述三唑醇偶联抗 原是由三唑醇半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、 兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白，所述三唑醇半抗原是由三唑酮与氨基己酸 在有机碱1，8_二氮杂二环十一碳-7-烯的催化下进行酮胺的缩合反应得到，分子结构式为：
[0007] 所述三唑醇单克隆抗体是以三唑醇偶联抗原作为免疫原制备获得。
[0008] 所述酶标记抗抗体中的抗抗体为羊抗鼠抗抗体。
[0009] 所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优 选辣根过氧化物酶;酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行 偶联得到的。
[0010]为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括三唑醇标准品溶液、底 物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。
[0011]所述三唑醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0 ng/Ul yg/Ld yg/Ld狀/1、27 yg/ L、81 yg/L〇
[0012]当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A 液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为卜2 mol/L的硫 酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐 缓冲液，所述终止液为1~2 mo 1 /L氢氧化钠溶液。
[0013] 所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.05%吐温-20、0.01%。硫柳汞防腐剂的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液，其中的百分比为质量体积百分比，单位g/mL。
[0014]所述复溶液优选为PH值为7 · 0、0 · 1 mol/L的磷酸盐缓冲液。
[0015]本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20 yg/mL，每孔加 入100 yL，37°C避光孵育2 h或4°C过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍干， 然后在每孔中加入150~200 yL封闭液，37 °C避光孵育卜2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用 铝膜真空密封保存。
[0016] 其中，在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6的0.05 mol/L碳酸 盐缓冲液，封闭液为pH值为7.4，含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0.1~0.3 mol/L的磷酸盐缓冲 液，所述百分比为质量体积百分比。
[0017] 本发明的检测原理为： 在微孔条上预包被三唑醇偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入三唑醇单 克隆抗体溶液，样本中的三唑醇与酶标板上包被的三唑醇偶联抗原竞争三唑醇单克隆抗 体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与三唑醇的残留量呈负 相关，与标准曲线比较即可得到样本中三唑醇的残留量;同时根据酶标板上颜色的深浅，与 系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样本中三唑醇残留量的浓度范围。
[0018] 本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测三唑醇残留量的方法，它包括 步骤： (1) 样本前处理； (2) 用试剂盒进行检测； (3)分析检测结果。
[0019] 本发明检测三唑醇的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检 测样本中三唑醇的残留量;对样本的前处理要求低，样本前处理过程简单，能同时快速检测 大批量样本;主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、 精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携 带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样本筛选的定性、定量检测。
【附图说明】
[0020] 图1:三唑醇半抗原合成路线图 图2:试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0022] 实施例1试剂盒组分的制备 1、三唑醇半抗原的合成(合成路线见附图1)及鉴定 取1.0 g三唑酮加乙醇溶解，加入0.35 g 1，8_二氮杂二环^^一碳-7-烯(DBU)，搅拌，再 加入0.87 g氨基己酸水溶液，加热回流反应12 h;停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水和1.3 g 氢氧化钾，震荡，加乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相调节pH值到4，加乙酸乙酯萃取，有机相 水洗，无水硫酸钠干燥蒸干，得到浅黄色油状物，二氯甲烷/石油醚（l:l〇，V/V)重结晶，得到 半抗原产物0.76 g，收率69%。
[0023] 取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，1H-匪R(CDC13，300ΜΗζ)δ:11·00(1Η，s)， 7.5Κ1Η, ddd, J=8.132, J=5.483, J=1.670) , 7.46( 1H, ddd, J=8.132, J=5.485, J= 1.670),6.94(1H, dd, J=8.132, J=5.485),6.94(1H, dd, J=8.132, J=5.483),6.52 (1H),8.270(1H, d, J=1.903),8.1(1H, d, J=1.903), 3.87C2H, t, J=7.434),1.25(3H, s)a.25(3H, s),1.25(3H, s)a.