84(2H, tt, J=7.434, J=7.022) ,1.41 (2H, tt, J= 7.434, J=7.022)，1.55(2H, tt, J=7.434, J=7.367)，2.30(2H, t, J=7.367)。图谱中化 学位移δ=11.0的为间隔臂上羧基氢共振吸收峰，3=1.85、1.41、2.30的为间隔臂上亚甲基氢 的共振吸收峰，这些峰的存在，证明间隔臂偶联成功，三唑醇半抗原结构正确。
[0024] 2、三唑醇偶联抗原的合成及鉴定 免疫抗原制备--三唑醇半抗原与牛血清白蛋白（BSA)偶联得到免疫抗原。
[0025] 取14 mg半抗原，溶解于lmL Ν，Ν-二甲基甲酰胺(DMF)中；称取BSA 50 mg，使之充 分溶解在3.8 mL 2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液(MES)(pH 5.0)中，将半抗原缓慢滴加到蛋白 溶液中；取30 mg碳化二亚胺(EDC)用0.2 mL MES(pH5.0)充分溶解后加入半抗原蛋白混合 液中，室温下搅拌24 h;用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4°C透析3 d，每天换3次透析液； 分装，于-20°C保存备用。
[0026]三唑醇半抗原与血蓝蛋白偶联得到免疫原。
[0027] 称取血蓝蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M的磷酸盐缓冲液PBS(PH 7.2) 中，得到溶液A;取30 mg碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2 mL水充分溶解 后于加入溶液A中，室温下搅拌30 min。取6 mg半抗原，溶解于1 mL N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4°C透析3 d 每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0028]三唑醇半抗原与甲状腺蛋白偶联得到免疫原。
[0029] 称取甲状腺蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M的磷酸盐缓冲液PBS(PH 7.2)中，得到溶液A;取30 mg碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2 mL水充分 溶解后于加入溶液A中，室温下搅拌30 min。取8mg半抗原，溶解于1 mL N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4°C透析3 d 每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0030]包被抗原制备一一三唑醇半抗原与卵清蛋白（0VA)偶联得到包被抗原。
[0031 ] 取14 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中；称取0VA 50 mg，使之充分溶解在3.8 mL MES (pH 5.0)中，将半抗原缓慢滴加到蛋白溶液中；取30 mg EDC用0.2 mL MES(pH5.0)充分溶 解后加入半抗原蛋白混合液中，室温下搅拌24 h;用0.01 mol/L PBS 4°C透析3 d，每天换3 次透析液;分装，于_20°C保存备用。
[0032] 三唑醇半抗原与人血清白蛋白偶联得到包被原。
[0033] 称取人血清白蛋白5〇11^，使之充分溶解在3.8 1^0.謂？83(?!17.2)中，得到溶 液B;取30mg EDC和NHS用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液B中，室温下搅拌30 min。取14mg 半抗原，溶解于lmL DMF中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4°C透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0034]三唑醇半抗原与兔血清白蛋白偶联得到包被原。
[0035] 称取兔血清白蛋白5〇11^，使之充分溶解在3.8 1^0.謂？83(?!17.2)中，得到溶 液B;取30mg EDC和NHS用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液B中，室温下搅拌30 min。取14mg 半抗原，溶解于lmL DMF中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4°C透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。
[0036]按合成三唑醇偶联抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外 (200~400 nm)扫描测定，通过比较三者分别在260 nm和280 nm的吸光值计算其结合比。 偶联物三唑醇半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与三唑醇半抗原、载体蛋白的最大吸收峰相 比发生了明显的变化，表明三唑醇半抗原-载体蛋白的合成是成功的。经计算，半抗原与BSA 的结合比为13:1，与0VA的结合比为8:1。
[0037] 3、三唑醇单克隆抗体的制备 (1)杂交瘤细胞的获得 1) 首次免疫:将三唑醇半抗原-BSA偶联物(免疫抗原）与等量的弗氏完全佐剂充分乳 化，皮下注射6周龄的Balb/c小鼠，每只0.2 mL; 2) 加强免疫两次:从首次免疫开始，每两周加强免疫一次，用弗式不完全佐剂代替弗氏 完全佐剂，方法和剂量同首次免疫； 3) 最后一次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000 以上时进行如下末次免疫:腹腔注射不加任何佐剂的免疫原溶液0.1 mL，三天后处死小鼠， 取其脾脏与骨髓瘤细胞融合； 4)采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对 阳性孔进行克隆化，得到并建立稳定分泌三唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株，取处于对数 生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。
[0038] (2)单克隆抗体的制备 1) 细胞复苏:取出三唑醇单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37°c水浴中速融， 尚心去除冻存液后，移入培养瓶内培养； 2) 制备腹水与抗体纯化:采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油 0.5 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5 X 105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵 法进行纯化，得到三唑醇单克隆抗体溶液(_20°C保存）。
[0039] (3)单克隆抗体效价的测定 用间接竞争ELISA法测定抗体的效价为1: (200000~500000)。
[0040] 间接竞争ELISA方法：用三唑醇半抗原-0VA偶联物包被酶标板，加入三唑醇标准品 溶液、三唑醇单克隆抗体溶液和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体溶液，25°C反应30 min，倒出孔内液体，用洗涤液洗涤3~5次，用吸水纸拍干;加入底物显色液，25°C反应15 min 后，加入终止液终止反应;设定酶标仪于波长450 nm处测定每孔吸光度值。
[0041] (4)单克隆抗体特异性的测定 抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该类抗原类似物结合能力的比较，常 用交叉反应率作为评价标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越高。
[0042] 本实验将三唑醇类杀菌剂(三唑醇、环唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇、联苯 三唑醇)做系列稀释，分别与单克隆抗体进行间接竞争ELISA，制作标准曲线，分析得到IC50， 然后按下式计算交叉反应率：
结果显示各类似物的交叉反应率为:三唑醇100%、环唑醇< 1 %、粉唑醇< 1 %、戊唑醇< 1 %、己唑醇< 1 %、烯唑醇< 1 %、联苯三唑醇< 1 %。本发明抗体对环唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑 醇、烯唑醇、联苯三唑醇等其他三唑醇类杀虫剂无交叉反应，只针对三唑醇有特异性结合。
[0043] 4、羊抗鼠抗抗体的制备 以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。
[0044] 5、酶标记抗抗体的制备 将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的 过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4:1，由于辣根过氧化物酶在强氧化 作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的 桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题， 我们将传统的方法进行了改良，即： (1) 省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很