吸收光谱扫描流动血细胞计数的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请是申请日为2012年05月31日、申请号为201280031089.7,发明名称为"吸收 光谱扫描流动血细胞计数"发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及流体流中的荧光粒子的光学分析的领域。
【背景技术】
[0003] 流动式粒子分析仪(诸如流动血细胞计数器)是公知的分析工具，其能够基于诸如 光散射和荧光的光学参数来表征粒子。在流动血细胞计数器中，例如，流体悬浮液中的粒子 (诸如分子(molecule)、与分析物结合的珠子或个体细胞)通过探测区域，在该探测区域中， 粒子暴露到通常来自于一个或多个激光器的激发光，并且粒子的光散射和荧光特性被测 量。其粒子或成分通常由荧光染料标记，以有助于探测，并且可以通过使用光谱有区别的荧 光染料来标记不同粒子或成分，以同时探测多种不同粒子或成分。通常，有多种光电探测 器，每一个光电探测器用于被测量的每个散射参数，并且每一个光电探测器用于被探测的 每个有区别的染料。所获得的数据包括对于光散射参数和荧光发射中每一个测量的信号。
[0004] 血细胞计数器还包括用于记录所测量的数据和分析数据的装置。例如，通常，数据 存储和分析是使用连接到探测电子装置的计算机来进行的。数据通常被以表格形式存储， 其中每一行对应于每个粒子的数据，并且列对应于每个所测量的参数。用来存储来自于流 动血细胞计数器的数据的标准文件格式(例如"FCS"文件格式)的使用有助于使用独立的程 序和机器来分析数据。使用当前的分析方法，为了易于可视化，数据通常被显示为2维(2D) 图表，但是其他方法可以被用来将多维数据可视化。
[0005] 使用流动血细胞计数器测量的参数通常包括由粒子沿着几乎向前的方向散射的 激发光(被称作为前向散射(FSC))，由粒子沿着几乎侧向散射的激发光(被称作为侧向散射 (SSC))以及从荧光粒子以光谱的一个或多个通道(频率范围）发射的光(被称作为FL1、FL2 等)或者由主要在该通道探测的荧光染料发射的光。不同的细胞类型可以由由于利用染料 标记的抗体对各种细胞蛋白质标记而产生的散射参数以及荧光发射来识别。
[0006] 流动血细胞计数器可以从例如BD Biosciences(San Jose，CA)买到。流动血细胞 计数器在本领域中在各种文献中充分描述，例如包括：Landy等人合编，Clinical Flow Cytometry,AnnaIs of the New York Academy of Sciences Volume 677(1993);Bauer等 人合编，Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications,ffi 11 iams&ffilkins (1993) ;0rmerod编写，Flow Cytometry : A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997) ;Jaroszeski等人合编，Flow Cytometry Protocols，Methods in Molecular Biology No .91，Humana Press( 1997);以及Shapiro，Practical Flow Cytometry第四版， Wi 1 ey-Liss(2003);通过引用将它们全部结合在这里。通过由多颜色流动血细胞计数器进 行的细胞(或其他粒子)的分析获得的数据是多维度的，其中每个细胞对应于由所测量的参 数限定的多维空间中的点。细胞或粒子的布居(population)被识别为数据空间中的点的 簇。因此，布居和簇的识别可以通过绕显示在数据的一个或多个2维图（被称作为"散射图" 或"点图"）绘出门限（gate)来手动地进行。可选择地，簇可以被识别，并且限定布局的限制 的门限可以被自动地确定。用于自动化门限的大量方法已经在文献中描述了。例如参见美 国专利号 4,845,653、5,627,040、5,739,000、5,795,727、5,962,238、6,014,904、6,944， 338，通过引用将他们全部结合在这里。
[0007] 在典型的基于激光器的流动血细胞计数器中，可用的激发波长受到合适的激光器 的可用性的限制。波长可选择的单波长激发源已经被描述为用于流动血细胞计数器。例如， 美国专利No.4,609,286(Sage)描述了流动血细胞计数器，其使用色散棱镜来从用作激发源 的光谱丰富光源选择波长。光源由棱镜色散，使得波长可以使用狭缝来选择，以允许基本单 波长的光通过，并阻挡全部其他波长。期望的波长可以通过将狭缝物理地移动到光谱中的 期望波长来选择。
[0008] Telford等人在2009年于Cytometry A 75(5) :450-459描述了使用超连续谱白色 激光作为流动血细胞计数器的激发源。超连续谱白色激光器在从近紫外到红外的宽波段范 围内连续地发射，由此对于人眼看起来是白色的。Telford等人描述了将声光滤波器或有涂 层的带通滤波器插入到光束的前方，以隔离具体波长范围，从而允许用户从超连续谱选择 感兴趣的带宽。所得到的激发源可以被用来通过使用具有期望颜色透射要求的滤波器选择 任何单激发波长和带宽。
[0009] 在典型流动血细胞计数器中，荧光发射被在多个探测通道(每个探测通道被限定 为光谱内的频率范围）中测量，其中，每个通道中的发射被使用单个光电探测器测量。因此， 每个探测器提供频率的范围的单个测量结果。典型地，探测器通道被选择为使得每个通道 被优化，以从不同染料之一探测发射。可选地，发射光可以使用探测通道的阵列来测量，使 得每个染料发射被在一个以上通道中测量。
[0010] Robinson等人在由Tuan Vo-Dinh等人编辑的Advanced Biomedical and Clinical Diagnostic Systems III,Proc.of SPIE Vol.5692(SPIE,Bellingham,WA, 2005) :3579-365中描述了一种流动血细胞计数器探测系统，其中发射的光由衍射光栅色散 到32通道PMT探测器上。因此，焚光发射可以在32个窄的、相邻的探测通道中测量，这些探测 通道一同跨越光谱区域。代替对于每个染料的单个荧光强度值，使用该系统获得的数据对 于每个染料包括对于多个相邻探测通道的强度值。从多个光谱相邻的探测通道获得的测量 结果的集合取决于染料的发射光谱。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了用于分析流动流中的荧光粒子的激发光谱的系统和方法。
[0012] 本发明的系统使用白光激光器和颜色分离光学器件来提供空间分布的、连续的颜 色光谱激发系统，其被用于照明流动流的区域。激发光的光谱沿着流动流的长度展开，使得 光谱展开到比待检测的粒子的直径大得多的区域。流动通过探测区域的粒子将会在任何一 点仅由小的波长范围激发，但是在其横穿整个探测区域时将会暴露到激发光的全部光谱。 随着荧光粒子行进通过激发束并且由此通过连续地改变激发光的波长而受到激发，探测器 测量来自于粒子的荧光发射，该荧光发射按照在每个波长的激发效率来改变强度。其结果 是扫描粒子的激发光谱。
[0013] 激发光谱的空间扩展（展开)是通过使光穿过诸如棱镜或衍射光栅的颜色分离光 学器件(例如色散元件)来实现的。颜色分离光学器件被确定方向，使得光谱沿着流动路径 展开，从而覆盖纵向探测区域。在流中流动的粒子将会随着其穿过探测区域而暴露到连续 地改变波长的光。
[0014] -般来说，光谱可以沿着流动路径展开，使得移动粒子将会从短波长到长波长或 者从长波长到短波长扫描(sweep)激发光谱。优选地，光谱沿着流动路径展开，使得移动粒 子将会从短波长到长波长扫描激发光谱。
[0015] 在一个实施例中，单个宽波段探测器被用于测量来自于在粒子穿过探测区域时由 连续光谱激发束激发的粒子的发射。因此，粒子发射可以在粒子由激发光的全光谱顺序地 激发时被连续地测量。由单探测器探测的波长的范围优选地被选择为在荧光粒子发射的范 围内，但是在激发光谱之外。优选地，探测器被构造为使用合适的长通滤波器测量比最长激 发波长更长的全部波长。
[0016] 在另一个实施例中，激发光源引起连续可变的、波长可选择的带通滤波器(可调谐 滤波器），其定位在白光激光器激发光源和颜色分离光学器件之间。滤光器允许从由白光激 光器提供的颜色的范围选择任何基本单颜色(波长的窄波段)的激发束。该基本单颜色的激 发束将会照明探测区域内的单个点。因为光谱由颜色分离光学器件展开到探测区域并且色 散的角度取决于光的颜色，所以由滤波器选择的激发光的颜色的改变也导致探测区域内的 照明点的位置的改变。
[0017] 连续可变的、可选择波长的带通滤波器被构造为将激发光的波长从光谱的一端连 续地改变到另一端，这也导致照明点从探测区域的一端扫到另一端。滤波器的改变速率也 被计时，使得照明点以与粒子在流动流中的速率相同的速率穿过探测区域。通过在粒子进 入探测区域时开始光谱扫描，粒子将会在其穿过探测区域的同时保持被照射，然而是被以 激发光谱的连续改变的颜色照射。
[0018] 连续改变的光谱扫描被与粒子流动对准，并且使得能够使用粒子运动扫描通过光 谱，但是将激发光限制到粒子，并且可能限制到受限的围绕区域。这将可能导致探测通道中 的信号噪声的杂散激发光的