测通道630与激发束的发射光谱重叠。因此，如果激发束的全部光 谱会连续地照射流动通道，则激发束光谱与探测通道630重叠的部分将会与该通道内FP2荧 光的探测相干涉。
[0108] 图6中示出的探测方案优选地被用于图3和图4中示出的仪器和方法。如上所述，随 着粒子移动通过流动通道并且通过持续改变激发波长而被激发，在任意一个时刻仅基本单 个波长照射到粒子。激发束从约450nm的波长扫描到约600nm，从而跟踪粒子的移动。在该扫 描期间，在激发束在探测通道630的截止波长以下的同时，没有激发光束可以被散射且比得 上FP2荧光的探测。因此，当在450-550nm的范围上扫描在FP2激发光谱期间，探测通道630可 以被用来探测来自于FP2的发射。
[0109] 一旦激发束已经到达探测通道630的阈值，探测通道630不再被用来测量来自于 FP2的发射。然而，探测通道640仍可以被用来测量来自于FP2的发射。在探测通道640中来自 于FP2发射测量结果的信号被放大，以补偿较低的探测灵敏度。因此，FP2的激发光谱可以被 在全部激发束光谱上扫描，在探测通道640(具有较低灵敏度）中测量，或者在完成使用探测 通道640(具有较低灵敏度)扫描之后，片段地使用探测通道630(具有高灵敏度)在范围450-550nm上测量。
[0110] 图6描述了使用两个重叠探测器通道以使得能够在更宽的范围内以更高的特异性 扫描激发光谱的探测方案。清楚地，可以使用额外的探测器通道。每个探测通道可以增加所 执行的、高度有效地探测发射的激发光谱扫描的范围。
[0111] 多个探测器通道不需要重叠。例如，探测器通道630也可以由透过在550nm到630nm 之间的光的带通滤波器限定，630nm是下一个探测器通道的起点
[0112] 图6中示出的探测方案也适合于测量其他荧光粒子(诸如FP1)的激发光谱，如上文 描述并在图5中示出的。为了测量FP1的激发光谱，探测通道630可以被忽略，或者可以被用 来在激发扫描的第一部分期间改善FP1的发射的测量。一般来说，通过提供一组交错的探测 通道，可以测量具有与白光激光器的光谱重叠的激发光谱的任何荧光粒子。在激发光被改 变横跨光谱的同时，来自分离的探测通道的信息优选地被结合，以获得荧光发射的最灵敏 的测量。
[0113] 图7
[0114] 图7描绘了本发明的另一个实施例的激发束光谱和探测器通道，连同第二示例性 荧光粒子(在这里被称作为FP2)的激发和发射光谱以及第三示例性荧光粒子(在这里被称 作为FP3)的激发和发射光谱。FP2的激发光谱710和发射光谱720以及FP3的激发光谱715和 发射光谱725仅为了示意性目的而示出，以帮助于理解本发明，并且不意图表示任何具体荧 光染料的光谱。X轴是波长，并且y轴是用于示意性说明标准化光谱的任意刻度。在该示例 中，荧光粒子FP2表现在约510nm处的激发峰和在约585nm处的发射峰(具有75nm的斯托克斯 频移），并且荧光粒子FP3表现在约550nm处的激发峰和在约625nm处的发射峰(具有75nm的 斯托克斯频移）。
[0115] 激发束光谱的极限（由激发源发射的波长的范围）和探测通道的极限（用于探测粒 子荧光的波长的范围）被示意性地示出为在粒子光谱下方沿着X轴的条。在该示例中，假设 激发束的光谱的范围从450到600nm。由带通滤波器限定的第一探测通道730探测在约560-590nm范围上的波长的发射。该第一探测通道大致对应于FP2的发射极值，而上波长边界被 选择为避免包含来自FP3的大量发射。该第一探测通道也被称作为FP2通道。由第二带通滤 波器限定的第二探测通道740探测在约625-710nm范围上的波长的发射。该第二探测通道大 致对应于FP3的发射极值，而下波长边界被选择为避免包含来自FP2的大量发射。该第二探 测通道也被称作为FP3通道。
[0116] 如可以从图7看到的，FP2通道测量FP2发射的大部分，但是测量FP3的发射的小部 分。类似地，FP3通道测量FP3发射的大部分，但是测量FP2的发射的小部分。两个探测通道的 对应于两个染料激发极值的选择使得能够相对独立地测量两个染料发射，这进一步使得能 够相对独立地测量两个染料激发光谱。
[0117] 图7中示出的探测方案优选地用于图3A-图3C以及图4A-图4D中示出的仪器和方 法。如上所述，随着粒子移动通过流动通道并且通过持续改变激发波长而被激发，在任意一 个时刻仅基本单个波长照射到粒子。激发束从约450nm的波长扫描到约600nm，从而跟踪粒 子的移动。在该扫描期间，在激发束在FP2探测通道730的波长以下的同时，没有激发光束可 以被散射且比得上FP2荧光的探测。因此，当在450-560nm的范围上扫描在FP2激发光谱期 间，FP2探测通道730可以被用来探测来自于FP2的发射，450-560nm的范围表示FP2对其表现 明显激发的波长的大部分范围。
[0118] 因为FP3通道在激发光波长范围之外，所以在FP3通道中没有检测到散射的激发光 束。因此，当在激发光波长的整个扫描上扫描FP3激发光谱期间，FP3通道740可以被用来检 测来自于FP3的发射。因为FP3的激发光谱超出了激发光波长的范围，所以这提供了 FP3的激 发光谱的大部分，但并非全部。
[0119] 图7描述了使用与将会用在试验中的具体染料匹配的探测器通道的探测方案的示 例。对应于染料激发极值的探测通道的选择使得能够相对独立地测量染料发射，这进一步 使得能够相对独立地测量染料激发光谱。虽然在图7中示出了两种染料，但是这种探测方案 可以通过使用对应更高数目的探测通道而应用到大量的光谱不同的染料的分析，每个探测 通道与具体染料的发射匹配。
[0120] 本发明的实施例的优点是其有助于分析由多种染料标记的粒子。例如，与典型的 通过流动血细胞计数器进行细胞分析的情况相似地，细胞可以由大量不同染料标记，每种 染料结合到不同的细胞蛋白质。这种多重标记的细胞将会表现出由于染料结合而产生的全 部激发光谱。通过使用与各个染料匹配的探测器并且因此能够相对独立地测量染料发射， 激发光谱可以被更加容易地分离为与结合的每种染料的激发光谱相对应的成分。
[0121] 本领域中已知将作为不同光谱的卷积的光谱数学地分离(解卷积)为成分光谱的 方法(例如，见Robinson等人所著的supra)。这种方法可以被用来在本方法中计算每个成分 染料的分布，并且因此识别存在于粒子(诸如细胞)上的标记。
【主权项】
1. 一种用于测量流体流中的荧光粒子的激发光谱的流动式粒子分析仪，所述流动式粒 子分析仪包括： a) 发射准直的宽光谱激发光束的激发光源， b) 将激发光束聚焦并引导到所述流体流中的探测区域上的激发光学器件，其中所述激 发光学器件包括使激发光束的光谱色散的色散元件，并且其中所述色散元件被确定朝向以 使得产生的连续改变波长的光谱色散在小管通道的探测区域上，使得穿过所述小管通道的 粒子将会横穿激发光束的色散的连续的光谱；以及 c) 测量从探测区域中的粒子发射的光的探测光学器件。2. 根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，还包括光学小管，光学小管具有延伸通过 所述光学小管的所述小管通道，其中所述流体流穿过所述小管通道，并且其中流体流中的 所述探测区域在所述小管通道中。3. 根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述激发光源包括白光激光器。4. 根据权利要求3所述的流动式粒子分析仪，其中，所述激发光源还包括限制由白光激 光器发射的波长的范围的滤波元件。5. 根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括光电探测 器，所述光电探测器构造为测量比被引导到探测区域上的激发光的光谱中的波长更长的波 长的范围。6. 根据权利要求1所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件被构造为获得由 探测区域中的粒子产生的发射光谱。7. 根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述发射光谱是由探测区域中的粒 子产生的全部发射光谱的至少大部分。8. 根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括长通滤波 器。9. 根据权利要求6所述的流动式粒子分析仪，其中，所述探测光学器件包括单个探测 器。10. 根据权利要求9所述的流动式粒子分析仪，其中，所述单个探测器是宽波段探测器。
【专利摘要】本发明涉及吸收光谱扫描流动血细胞计数。本发明提供了用于分析流动流中的荧光粒子的激发光谱的系统和方法。该系统使用白光激光器和颜色分离光学器件来提供用于照明流动流的区域的空间分布的、连续的颜色光谱激发光系统。穿过探测区域的粒子横穿激发光的全色散光谱，并且在粒子穿过探测区域时连续地测量来自粒子的荧光发射。所测量的在激发光的每个波长下的荧光发射提供了粒子的激发光谱，该激发光在粒子穿过探测区域时改变通过激发光的全光谱。
【IPC分类】G01N15/00, G01N21/64
【公开号】CN105606577
【申请号】CN201610070577
【发明人】P·O·诺顿, 陈永琴
【申请人】贝克顿·迪金森公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2012年5月31日
【公告号】CN103608664A, EP2724146A2, EP2724146A4, US20140093949, WO2012177367A2, WO2012177367A3