人鼠嵌合抗体ChAb26、乳腺特异性表达载体、转基因FVB小鼠及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明技术属于生物工程领域，尤其涉及一种抗P185CTbB2人鼠嵌合抗体ChAb26、乳 腺特异性表达载体、转基因 FVB小鼠及其制备方法。
【背景技术】
[0002] Shih等（1981年)科学家首次从大鼠胚胎神经母细胞中发现一种新的原癌基因，并 命名neu基因。随后通过核酸序列分析比对和染色体谱分析发现neu原癌基因与原癌基因 erb B存在高度同源性。因此，neu原癌基因被认为是erb B原癌基因的一种相关基因，并被 命名为erb B2/HER2<Xoussens等发现人的原癌基因 erb B2位于人17号染色体长臂的2区1 带（17q21 )，其编码产物是分子量为185kDa的受体酪氨酸激酶(RTK，receptor tyrosine kinase)，因而又被称为pl85蛋白。它是由1255个氨基酸残基组成的一种跨膜糖蛋白。RTK是 一个超家族(superfamily)，其成员包括erb B原癌基因编码产物表皮生长因子受体(EGFR， epidermal growth factor receptor)，以及 erb B2/HER2 受体、erb B3/HER3 受体和erb B4/HER4受体等。erb B受体非常广泛地分布于除血管组织之外的所有上皮细胞的细胞膜 上;erb B2受体常见于正常人各种体腔上皮、腺上皮及胚胎中，erb B2受体均在他们中存在 微弱表达;erb B3受体除在人造血系统未表达之外，其在人体多数部位均存在表达;erb B4 受体在除在肾小球及周围神经未表达外，其在其他组织均中均存在表达。膜外区、膜内区和 跨膜区（TM，transmembrane)组成了erb B2受体的主要结构。膜外区具有特异性，它与配体 相结合，接受信号，含有大量半胱氨酸残基重复序列；膜内区决定生长因子的胞内生物效 应。跨膜区主要功能是锚定受体和导致受体的变构效应，一般由22-26个氨基酸残基构成一 个α螺旋状结构，高度疏水;erb B2受体的功能区位于C末端，主要包括ATP的结合位点和酪 氨酸激酶功能区。erb B家族成员的突变在人类肿瘤中比较常见，尤其是erb B2,它们的主 要功能是刺激细胞生长。
[0003] erbB2受体的激活与肿瘤发生相关，除了胚胎发育等特定的发育阶段，erb B2在正 常组织中的表达量是很低的；而与之相反，在乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多种恶性肿瘤细胞中 都发现了erb B2基因的放大与pl85elrbB2蛋白的过表达。由于erb B2基因的放大与pl85elrbB2 蛋白的过表达，从而导致erb B2受体激活，并增强其介导的信号传导，最终导致正常的细胞 发生恶性转化以及形成恶性肿瘤。
[0004] Trastuzumab(H:e_reept__in?，又被称为赫赛汀，中文名为曲妥珠单抗）是作用于erb B2蛋白的人源化单克隆特异性抗体(humanized mAb)，是目前使用最广泛的抗erb B2高表 达的肿瘤的高效药物。Herceptin能特异结合在erb B2受体胞外subdomain IV区，从而阻断 erb B2同源二聚体和异源二聚体的形成，并介导erb B2受体的内吞和在溶酶体中降解，阻 断erb B2受体的功能，从而妨碍erb B2C00H-端尾巴的磷酸化活化和抑制MAPK和PI3K信号 途径，抑制细胞的生长。研究表明，Herceptin对人的erb B2受体是特异性的，仅作用于erb B2基因过表达的细胞系。其主要作用机制是通过它的IgGI Fc端(Crystalline Fragment， 结晶片段）高效地介导抗体依赖的细胞毒作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)杀伤erbB2过表达的肿瘤细胞。Herceptin单独使用即可以抑制癌症细 胞的生长，但它与其它细胞毒化疗药物联用更表现出突出的治疗效果，其作用机理是 Herceptin能阻遏erb B2受体介导的信号转导从而引起此1-2和8111^;^;[11等抗凋亡蛋白表 达下调，使得恶性肿瘤细胞对多柔比星、紫杉醇等的细胞毒化疗药物的敏感性提高。但是， 赫赛汀是由悬浮培养于无菌培养基中的哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CH0)生产的，是 一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体。其生产成本极高从而造成肿瘤患者治疗费用昂贵， 通过转基因动物乳腺生物反应器制备抗P185嵌合抗体极有可能有效解决这一缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体ChAb26、乳腺特异 性表达载体、转基因 FVB小鼠及其制备方法，所得人鼠嵌合抗体降低了鼠源单克隆抗体的免 疫源性，通过所得转基因 FVB小鼠生产药用重组蛋白具有产量高、成本低、活性高、易规模 化、能缩短新药上市周期和市场潜力巨大等优点。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：抗pl85elbB2人鼠嵌合抗体 ChAb26,主要由重链基因 Η和轻链基因 L组成，重链基因 Η和轻链基因 L分别具有序列表 SEQ· ID · No · 3和SEQ· ID · No · 6的碱基序列。
[0007] 上述抗pl85eibB2人鼠嵌合抗体ChAb26的乳腺特异性表达载体，为pBCl-H和pBCl-L， pBCl为乳腺特异性表达质粒。
[0008] 上述乳腺特异性表达载体的构建方法，将抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体ChAb26的重链 基因 Η和轻链基因 L分别连接到乳腺特异性表达质粒pBCl上，从而构建得到pl85CTbB2人鼠嵌 合抗体ChAb26乳腺特异性表达载体pBCl-Η和pBCl-L。
[0009] 上述的乳腺特异性表达载体的构建方法，按以下操作进行：
[0010] 〈1>以含有抗pl85el:bB2人鼠嵌合抗体ChAb26重链Η和轻链基因 L的pUC57/pBCN-H- F2A-L-ployA-EGFP-Neo质粒为模板，在LA Taq DNA聚合酶作用下，分别以H-F/H-R和L-F/L-R为引物扩增出抗pl85el:bB2人鼠嵌合抗体ChAb26重链基因 Η和轻链基因 L;PCR反应的程序为 94〇C5min；94〇C30sec ； 50〇C30sec ；69〇C2min30sec ； 35cycles ；69〇C7min?4〇C 00 ；
[0011] 〈2>使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将步骤〈1>扩增出的重链基因 H和轻链基因 L回收 纯化；
[0012] 〈3>将步骤〈2>回收的重链基因 Η和轻链基因 L分别连接到pEASY-ΤΙ克隆载体上，获 得重组子 pEASY-T 1-H 和 pEASY-T 1-L;
[0013] 〈4>使用Xho I对步骤〈3>获得的重组子pEASY-ΤΙ-Η和pEASY-Tl-L进行酶切并使用 乙醇沉淀法将酶切产物重链基因 Η和轻链基因 L进行回收纯化；
[0014] 〈5>将步骤〈4>回收的重链基因 Η和轻链基因 L分别与预先经Xho頂每切和CIP碱性 磷酸酶去磷酸化的乳腺特异性表达质粒PBC1在T7连接酶作用下连接，构建得到抗pl85 CTbB2 人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异性表达载体pBCl-Η和pBCl-L。
[0015] 引物 H-F/H-R和L-F/L-R分别具有序列表SEQ. ID. No · 1/SEQ. ID. No · 2、 SEQ· ID · No · 4/SEQ· ID · No · 5的碱基序列。
[0016] 转基因 FVB小鼠，特异性地表达抗pl85eibB2人鼠嵌合抗体ChAb26。
[0017]上述转基因 FVB小鼠的制备方法，将pl85eibB2人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异性表达 载体pBCl-H和pBCl-L线性化后，导入FVB小鼠受精卵获得。
[0018]上述转基因 FVB小鼠的制备方法，采用受精卵核显微共注射导入。
[0019] 上述转基因 FVB小鼠的制备方法，按以下操作进行：
[0020] 〈1>使用Not I和Sal I将抗pl85el:b B2人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异性表达载体 pBCl-H和pBCl-L进行线性化，获得抗p 185el:b B2人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺特异性 表达线性载体 pBCl-H-l inear 和pBCl-L-1 inear;
[0021] 〈2>将乳腺特异性表达线性载体pBCl-H-linear和pBCl-L-linear通过原核显微共 注射的方式进行受精卵共注射;注射完毕后，将受精卵移植至受体FVB系小鼠子宫内，妊娠 后获得代双阳性转基因 FVB小鼠。
[0022]使用上述转基因 FVB小鼠获取抗pl85el:bB2人鼠嵌合抗体ChAb26的方法，按以下操作 进行：孕鼠分娩10天后，使用小鼠挤奶器对转基因母鼠进行乳汁采集;然后，将采集到的乳 汁分别转移到灭菌Ep管内，4°C，4000 X g离心20min;离心结束后，轻轻吸出中层清澈液体， 即得抗P185el:bB2人鼠嵌合抗体ChAb26溶液。
[0023]针对目前鼠源单克隆抗体存在的问题，基于乳腺生物反应器和嵌合抗体原理，发 明人设计了一种抗ρ185#Β2人鼠嵌合抗体ChAb26及其乳腺特异性表达载体，并据此建立了 乳腺特异性表达载体的构建方法和转基因 FVB小鼠的制备方法。抗ρ185@Β2人鼠嵌合抗体 ChAb26,主要由重链基因 Η和轻链基因 L组成，重链基因 Η和轻链基因 L分别具有序列表 SEQ. ID.No. 3和SEQ. ID. No. 6的碱基序列。将其重链基因 Η和轻链基因 L分别连接到乳腺特异 性表达质粒PBC1上，从而构建得到pl85el:bB2人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异性表达载体pBCl-H和pBCl-L。将乳腺特异性表达载体pBCl-H和pBCl-L线性化后，导入FVB小鼠受精卵生产出 转基因 FVB小鼠，以其作为乳腺生物反应器，通过乳腺特异性表达而获得抗pl85CTbB2人鼠嵌 合抗体ChAb26。由于pBCl载体具有乳腺特异性表达的结构，用于构建转基因动物乳腺生物 反应器时能大量表达重组蛋白或抗体。据资料显示，由PBC1载体构建的转基因小鼠乳腺生 物反应器表达的重组蛋白含量可达到35g/L(Youngetal，1997)，转基因山羊乳腺生物反应 器表达的重组蛋白含量可达到20g/L(Zeomek，1998)。
[0024]本发明针对erbB2受体过表达的肿瘤细胞且人鼠嵌合抗体能大大地降低了鼠源单 克隆抗体的免疫源性，从而能有效避免抗抗体反应发生；与制备药用重组蛋白的细胞培养 或微生物发酵罐等传统技术相比，通过本发明所得转基因 FVB小鼠生产药用重组蛋白具有 产量高、成本低、活性高、易规模化、能缩短新药上市周期和市场潜力巨大等优点。同时，应 用本发明可为卵巢癌等erbB2受体过表达的恶性肿瘤的生物治疗进行了积极的探索。
【附图说明】
[0025]图 1 是实施例 1 中 pUC57/pBCN-H-F2A-L-ployA-EGFP_Neo 质粒图谱。
[0026]图2抗pl85el:bB2人鼠嵌合抗体ChAb26重链基因 Η和轻链基因 L的PCR扩增产物电泳 图，图中Μ是DNA marker 111;1，2是重链基因 Η;3,4是轻链基因 L〇
[0027]图3是实施例1中重组