大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36、其编码基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36、其 编码基因及应用。
【背景技术】
[0002] 土壤磷有50%~80%以有机态形式存在，植酸磷占一半以上;且植酸磷大多不溶 于水，不能被植物直接吸收利用（Lung et al.，2006;Bilyeu et al.，2008;George et al.，2008)。同时，每年施入土壤的大部分磷肥还会由于吸附、沉降和转化作用成为有机态 形式而被固定于土壤，不能被当季植物吸收(Baek et al.，2013;Wang et al.，2013)。据统 计，我国每年约施用1100万吨纯磷，占世界总用量30%左右，但磷肥当季利用率却仅有10% ~15%，相当于每年约有1000万吨纯磷积累于土壤，形成植物不能直接利用的非有效态(吴 平，2010)。由此可见，土壤中的总磷含量并不低，只是植物可吸收利用的有效态磷含量较 低，即所谓的"遗传学缺磷"。土壤现已成为巨大的"潜在磷库"，亟待开发利用（Rose et al.，2013;Teng et al. ,2013)。因此，如何充分利用土壤中的有机态磷(尤其是植酸磷），减 少外部磷肥施入量就成为磷素营养研究中的重要课题，对于提高磷肥利用效率、解决植物 磷素短缺、缓解磷肥危机及减少环境磷污染等均具有重要意义。
[0003] 土壤中的有机磷(植酸磷)不可被直接吸收利用，但可经根际周围磷酸酶或植酸酶 水解后释放出无机磷进而被吸收利用，因而植物根际周围的酸性磷酸酶或植酸酶对于提高 土壤磷的生物有效性具有重要作用（Richardson et al.，2001;Li et al.，2009;Tran et al. ,2010;Maougal et al. ,2014)。有学者发现，酸性磷酸酶是植物对缺磷胁迫最早和最剧 烈的反应之一，其活性高低甚至可以作为诊断植株磷素丰缺的指标，也可作为磷高效品种 遴选的生化指标(戴开结等，2006)。云杉根际土壤酸性磷酸酶活性为非根际土壤2.0~2.5 倍;油菜根际土壤中的磷酸酶活性可达到非根际土壤10倍;番茄在缺磷胁迫下的酸性磷酸 酶分泌量是正常条件的6倍(乔亚科等，2007)。可见，促使植株向根际分泌大量有活性、能分 解土壤有机磷的酸性磷酸酶，使有机磷分解为易于吸收利用的有效态，是增强植株抵御低 磷逆境的重要途径。
[0004] 近年来，有学者从水稻、拟南芥、苜蓿、菜豆、白羽扇豆、番茄、烟草、马铃薯等植物 中克隆获得酸性磷酸酶基因，且有些基因已在模式植物中开展功能研究(Madsen et al.， 2013;Sun et al.，2013;Zamani et al. ,2014)。但真正应用于植物转基因育种的却寥寥无 几，重要农作物磷高效转基因育种中仍然缺乏应用潜力大、功能明确的酸性磷酸酶基因（李 喜焕等，2012)。
[0005] 肖凯等(2006)将蒺藜苜蓿中的酸性磷酸酶MtPAPl转入拟南芥发现，在植酸盐为唯 一磷源条件下，超表达转基因植株的生物学产量、无机磷和全磷含量均明显高于对照;Ma等 (2009)将MtPAPl转入白三叶草，在有机态磷条件下，转基因植株的磷吸收量明显增加，生物 产量也较野生型有所提高，植株利用有机态磷的能力得到明显改善。谷俊涛等（2007)将白 羽扇豆中的酸性磷酸酶Apase转入白三叶草，植酸盐为唯一磷源条件下，超表达转基因植株 的磷素累积量、鲜重和干重显著增加，表明基因具有明显增强白三叶草吸收有机态磷的能 力。Bozzo等(2002)研究番茄酸性磷酸酶基因发现，该酶在酸性条件下可水解胞外磷脂化合 物释放出磷以供植物利用;Wang等(2009)将拟南芥酸性磷酸酶基因 AtPAPl 5转入大豆，在酸 性土壤中生长的3个转基因株系产量性状均明显优于野生型，单株荚数提高35.9%、 41.0%、59.0%，单株粒数提高46.0%、48.3%、66.7% liang等（2010)研究菜豆酸性磷酸 酶基因 PvPAP3发现，缺磷条件下，PvPAP3在叶和根中表达量升高，且在磷高效品种中的表达 量高于低效品种，与菜豆磷素利用效率显著相关，进一步分析还发现PvPAP3编码蛋白可通 过利用胞外ATP作为磷源使植物适应低磷状态。
[0006] 关于大豆酸性磷酸酶基因，Li等（2012)曾利用已测序大豆基因组序列，通过同源 比对与生物信息学分析方法进行预测，认为在大豆基因组中可能存在35个酸性磷酸酶基 因，经实时定量PCR分析这些候选基因表达差异发现，低磷(5μΜ KH2P〇4)处理条件下，基因分 别在大豆根系、茎杆、叶片、花瓣、豆荚、籽粒中诱导表达。尽管该研究预测了 35个大豆酸性 磷酸酶基因，但到目前为止，已克隆基因全长并开展功能研究的仅有4个（GmPAPl~ GmPAP4)。其中，GmPAPl、GmPAP2在低磷条件下诱导表达，但其功能研究并未深入开展 (LeBansky et al.，1992;Schenk et al.，1999;Liao et &1.，2003)。6111?厶？3是1^&〇等 (2003)克隆获得的酸性磷酸酶基因，然而该基因功能研究发现，仅受NaCl盐胁迫诱导，而不 受低磷胁迫诱导，是一个与大豆耐盐性密切相关的基因。GmPAP4是Kong等（2014)克隆获得 的酸性磷酸酶基因，该基因具有提高转基因拟南芥磷素利用效率的功能，也是目前报道的 大豆中唯一具有分解利用有机态磷功能的酸性磷酸酶基因 。可见，在诸多大豆酸性磷酸酶 候选基因中发掘与土壤有机磷(植酸磷)高效利用密切相关的功能基因非常必要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36、其编码基因及应用。
[0008]为了实现本发明目的，本发明的大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36,其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。
[0009] 本发明还提供所述大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36的编码基因，其为大豆紫色酸性 磷酸酶GmPAP36基因，该基因的cDNA序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 本发明还提供含有基因 GmPAP36的载体，优选地，出发载体包括但不限于pCamE、 ρΖΥΙΟΙο
[0011] 携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微 注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey， 1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0012] 本发明还提供含有基因 GmPAP36或上述载体的宿主细胞、工程菌及转基因细胞系。 [0013]本发明还提供基因 GmPAP36在提高转基因植物对环境中磷元素利用率中的应用。 其中，所述磷元素以有机态磷形式存在，优选地，所述有机态磷为植酸磷。
[0014] 本发明还提供基因 GmPAP36在植物品种改良中的应用。
[0015] 本发明中涉及的植物包括但不限于拟南芥、大豆（例如大豆品种'中黄15 '、'冀 NF58'）。
[0016] 本发明进一步提供一种转基因植株的构建方法，优选采用农杆菌介导法或花粉管 通道法，将含有基因 GmPAP36的载体转入植物中，筛选转基因植株。
[0017] 本发明利用大肠杆菌原核表达系统，获得了紫色酸性磷酸酶基因 GmPAP36原核表 达蛋白，在IPTG诱导条件下，GmPAP36基因表达出一条分子量61.2KDa的融合蛋白，而对照 (转空白质粒)无该蛋白。
[0018] 本发明的大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP36具有分解植株根际周围植酸磷、提高转基 因拟南芥及大豆根际植酸磷利用效率的功能，其特征如下：
[0019] (1)以植酸磷（土壤中有机态磷的主要存在形式）为唯一磷源处理42d~56d， GmPAP36基因在磷高效大豆品种'中黄15'中的表达量显著或极显著高于磷低效大豆品种 '牛毛黄'，且二者表达量的差异最大可达3.6倍，表明GmPAP36与植酸磷的分解利用密切相 关。
[0020] (2)与拟南芥野生型对照相比，转GmPAP36的T3代超表达拟南芥植株在植酸磷处理 下的缺磷症状明显减轻，表现出叶片较大、叶柄较长、生长势强等特点，且植株根系酸性磷 酸酶活性、植酸酶活性、植株磷含量均较对照显著或极显著增加，植株生物重也比野生型对 照提高39.3%，二者差异达极显著水平，表明GmPAP36具有提高转基因拟南芥根际周围植酸 磷利用效率的功能。
[0021] (3)与大豆野生型对照相比，超表达转GmPAP36大豆植株在植酸磷处理下的根系酸 性磷酸酶活性、植酸酶活性、植株磷含量均较对照显著或极显著增加，3个转基因株系的单 株荚数比野生型对照分别增加25.0%、19.7%、32.9%，单株粒重分别增加15.1 %、14.4%、 17.7%，且达到显著或极显著水平，说明由于GmPAP36的转入，使得转基因大豆能够分解利 用根际周围的植酸磷，提高了植株体内的磷素含量，受低磷影响较小，单株荚数和单株粒重 显著增加，GmPAP36具有分解利用转基因大豆根际周围植酸磷的作用。
[0022] 本发明利用前期基于抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH)技术构建的低磷诱导大豆根系cDNA差减文库，从中选择低磷胁迫诱导 表达的酸性磷酸酶候选EST，在此基础上，克隆酸性磷酸酶候选基因序列，采用实时定量PCR 技术分析候选基因在植酸磷处理条件下的表达差异;构建基因原核表达载体，实现基因原 核表达，同时构建基因真核表达载体，并转化拟南芥、大豆，获得转基因阳性植株，分析基因 的生物学功能，为植物磷高效转基因育种提供功能基因。
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例1中磷高效大豆品种'中黄15'在低磷处理条件下的cDNA进行 PCR扩增的结果图。其中1泳道为空白对照，2泳道获得约1.4kb左右的一条特异条带。该条带 与电子序列大小一致，回收该片段，与T载体连接，转化大肠杆菌，筛选重组子，经测序分析 获得扩增片段序列。图中Μ为DNA Marker DL 2000; 1为空白对照，2为'中黄15'低磷处理 cDNA的PCR扩增结果。
[0024]图2是本发明实施例2中植酸磷处理下GmPAP36基因在'中黄15'（磷高效大豆品种） 与'牛毛黄'（磷低效大豆品种)根系中的差异表达结果图。其中，横坐标表示植酸磷处理天 数，纵坐标表示GmPAP36在'中黄15 '与'牛毛黄'根系的表达量。
[0025]图3是本发明实施例3中GmPAP36基因原核表达蛋白SDS-PAGE电泳检测结果。图中 箭头所示为表达目的片段61.2KDa;M是蛋白标准分子量；1~3分别为未经IPTG诱导的空菌 株BL21、空质粒转化的BL21、重组质粒转化的BL21;4~6分别为IPTG诱导3h的空菌株、空质