减少细菌中接合型质粒的制作方法

减少细菌中接合型质粒的制作方法
【专利说明】减少细菌中接合型质粒
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2008年3月10日提交的美国申请第61/035,304号的优先权。 发明领域
[0003] 本发明提供方法和组合物，以减少见于包括细菌感染的微生物菌落中的各种质粒 的数量上(numerical)或质量上(mass)的量，并且本发明包括用于菌落处理的组合物、方法 以及用于鉴定其他此类组合物的方法。在多种实施方案中，本发明提供显著地减少携带于 靶细菌培养物中的抗生素抗性标记的流行。
[0004] 发明背景
[0005] 细菌是普遍存在的并且见于之前被认为不适于居住的环境中。它们是常见的且生 态学多样的，并且发现对于生存不寻常的和共同的生态位。它们遍布于环境存在，并且存在 于土壤、灰尘、水以及几乎所有天然表面上。许多是正常的和有益的细菌株，其提供与宿主 的协同关系。其他的不是这样有益的，或在特定条件下伴随益处造成问题。
[0006] 致病细菌可以在人类、其他动物以及植物中导致感染性疾病或明显症状。一些细 菌只可以影响特定宿主;其他的在许多宿主中导致问题，这取决于细菌的宿主特异性。其他 的在某些情况下可以是无害的或休眠的，并且在其他环境或情况下可以作为问题出现。无 论是细菌单独或联合导致的疾病，都几乎与细菌本身一样的多样并且包括食物中毒、蛀牙、 炭疽、普通感染性疾病以及甚至某些类型的癌症。这些临床问题通常是临床微生物学领域 的主题。
[0007] 细菌是某些病毒的天然靶标，所述病毒例如噬菌体（bacteriophage)或噬菌体 (phage)。噬菌体已在其天然宿主上进化并且具有非常快的复制和进化速率。噬菌体可以利 用其宿主生理学或生物学所表现出的最小的易损性（vulnerability)。同样地，噬菌体结 构、生理学和要素的适当利用应当对于最小化或控制细菌导致的问题是有用的。
[0008] 某些细菌通常是无害的，在合适的机会存在时变为致病的或在被引入异常位置或 环境时变为可导致问题的。此外，某些细菌组合共同进化并且可以协同运作以补充在菌落 个体成员中缺乏的功能。但是，例如在多细胞生物体中，存在许多各种各样的机制来处理不 同量的细菌激发，细菌培养物的完全根除通常不是必需的。在许多情况下，细菌群体的不完 全根除会降低感染的作用，以允许系统通过例如免疫系统的可选机制来解决问题。
[0009] 统计上，感染性疾病是主要的医学问题。参见，例如Watstein和Jovanovic(2003) Statistical Handbook on Infectious Diseases(感染性疾病统计手册）Greenwood, ISBN: 1573563757。在美国，每年大约40-70K的死亡来自于医院（医院来源的)血流感染。
[0010] 特别是，在过去的半个世纪，抗生素使临床医学产生革命性变化。自从抗生素现象 的最初发现，作用机制和这类突出的治疗实体的开发得到了巨大的进展。参见，例如 Therrien和Levesque(2000)FEMS Microbiol·Rev·24:251-62;Durgess(1999)Chest 115 (3Suppl):19S-23S；Medeiros(1997)Clin.Infect.Dis.24(Suppl 1):S19-45；Jones(1996) Am. J.Med. 100(6A) :3S-12S;Ford和Hait(1993)Cytotechnology 12:171-212;以及Liu (1992)Compr. Ther. 18:35-42。2002年，抗生素具有约$320亿的世界范围的销售额。
[0011] 抗生素抗性细菌的广泛出现突出了现有抗菌治疗对于细菌适应的易损性。参见， 例如 Wi se (2007) 〃An overview of the Specialist Advisory Committee on Antimicrobial Resistance(SACAR)(抗菌剂抗性专家顾问委员会概述）〃 J.Antimicrob.Chemother.60Suppl 1:i5-7.PMID:17656382；Finch(2007)//Innovation-drugs and diagnostics(革新-药物和诊断学）〃J.Antimicrob.Chemother.60 Suppl 1: i79_82，PMID: 17656390; Walsh (1992) Antibio tics: Actions，Origins，Resistance (抗生 素：作用、起源、抗性）Amer.Soc .Microbiol ·，ISBN: 1555812546 ;Cunha(1992)Antibiotic Essentials (抗生素要素 ）Physicians Press，ISBN: 1890114413; Amyes (2003 )Magic Bullets,Lost Horizons:The Rise and Fall of Antibiotics(神奇的子弹，失落的地平 线：抗生素的兴衰）Taylor&Francis，ISBN: 0415272033 ; Axelsen(2001 )Essentials of Antimicrobial Pharmacology:A Guide to Fundamentals for Practice(抗菌剂药理学 要素：实践基础指南）Humana Press，ISBN: 0896038424;以及Mainous和Pomeroy(eds · 2001) Management of Antimicrobials in Infectious Diseases: Impact of Antibiotic Resistance (感染性疾病中抗菌剂的管理：抗生素抗性的影响）Humana Press，ISBN: 0896038211。
[0012] 此外，抗生素抗性的机构在最低选择条件下发展(例如在低浓度的抗生素下），并 且这些机构经常在宿主之间转移。因此，机构在不同生物中进化，并且经常被引入新的宿 主，在新的宿主中这些相同的机构被进一步完善和优化。经常，机构的组合被生成、被遗传 上连接在一起，并且在细菌宿主之间一起转移。这些组合经常导致编码连接的多药物抗性 标记的DNA节段的基因聚类(clustering)。
[0013]因此，用于减少抗性编码质粒的流行、生长或存活，或用于限制细菌毒力或致病性 的改进的方法会具有巨大的功用。该功用可以适用于环境的、局部的（local)、局部的 (topical)或特别是体内的定殖(colonization)。本发明致力于这些和其他重要的问题。 [0014] 发明概述
[0015]本发明部分地基于以下认识:存在可以感染很多不同宿主的多种宽宿主范围噬菌 体。参见，例如Grahn，et al.(2006)"PRDl:Dissecting the Genome, Structure and Entry〃（PRDl:剖析基因组、结构和进入）in Calendar(ed. )The Bacteriophages(·菌体） (2d ed.)0xford Univ.Press, 158113:9780195148503 41^1 是复层噬菌体科 (丁6〇1：；^；[1^(1&6)属的示例性成员，其在结构上和功能上被定义。但是，分类方案在演变并且 认识到噬菌体与高等动物腺病毒功能的相似性。这表明某些基本结构特征是共享的，这些 噬菌体利用所述基本结构特征以达到在广泛多种的宿主细菌种中感染和复制的共同目的。 特别是，这些宽宿主范围跨越革兰氏阴性和革兰氏阳性的区别，这提示某些结构特征在结 合和感染进程中是共享的。编码抗生素抗性机构的很多遗传元件也可以包含针对含有那些 遗传元件的细胞的易损性的装置。例如，某些编码抗生素抗性基因的细菌质粒也编码使宿 主细胞易受损于噬菌体结合（以及杀死）的受体。可选地，质粒可以编码可以被转移到缺乏 所述质粒的其他细胞中的基因或结构，从而导致抗性基因和连接的易损性标记的转移。该 机构可以用作抗性或毒力编码质粒向相似的缺乏抗性标记的宿主的横向传递的装置。如果 易损性基因也被转移，那么这些宿主对于清除装置变为敏感的。.
[0016] 本发明提供有效地靶向于含有编码抗生素抗性或毒力的某些遗传元件、特别地可 传递形式的遗传元件的细胞的装置。在其他实施方案中，提供将噬菌体结合和/或杀死易感 性转移到广泛多种靶宿主细菌的装置。
[0017] 本发明提供减少异质细菌培养物中编码例如复层病毒（tectivirus)的噬菌体的 受体的接合型质粒的流行的方法。所述方法使用生物系统（以噬菌体或其部分为例）的其对 于含有遗传元件的靶细胞的抗菌活性(根除/减少携带如抗生素抗性、毒力等不希望性质的 细菌的数量），所述生物系统取决于细菌交配对形成系统（mating pair formation system)(以接合型菌毛或其部分为例）。
[0018] 作为任选的第一步骤，通过以下产生包含接合型质粒并表达噬菌体受体的宿主细 菌:将细菌培养物暴露于提供编码噬菌体受体的接合型质粒从所述细菌培养物的供体成员 到接受体(recipient)成员的转移的交配对形成系统，并且允许所述系统实现所述接合型 质粒从所述细菌培养物的所述供体成员到所述接受体成员的转移。作为第二步骤(或者第 一步骤，如果未进行之前的步骤），一旦表达噬菌体受体的宿主细胞存在，将细菌培养物暴 露于结合所述受体的合适的噬菌体。作为噬菌体生命周期的部分，其杀死宿主细菌，因而减 少异质细菌培养物中编码所述噬菌体受体的接合型质粒的流行。
[0019] 在一实施方案中，流行的减少是所述细菌培养物中所述接合型质粒的相对或绝对 数量的减少;或每所述细菌培养物成员的所述接合型质粒的相对或绝对数量的减少，或异 质细菌培养物中发现的含有所述质粒的宿主的相对或绝对数量的减少。在其他实施方案 中，流行的减少为比暴露于交配对系统之前的流行至少少2倍。
[0020] 在一实施方案中，噬菌体是，例如宽宿主范围的含有脂质的噬菌体，包括复层病 毒;PRD1噬菌体群(group)的成员；质粒依赖性宽宿主范围噬菌体;复层噬菌体科，以二十面 体形态、脂质包含物、55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个或多个为特征的噬菌 体；或选自以下命名为 PRDl、PRRl、PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GIL01、pGIL01、BAM35SGIL16 的噬菌体。
[0021 ]在一实施方案中，接合型质粒，例如选自不相容性群N、P或W质粒;编码在噬菌体复 制中重要的一种或多种其他蛋白（例如质粒上功能是结合、感染、复制或裂解的蛋白）；编码 一种或多种抗生素抗性、选择或毒力标记;是以与所述成员的染色体分开的DNA的形式;或 编码一种或多种菌毛基因。
[0022] 在一实施方案中，异质细菌培养物是，例如处于对数生长阶段;处于稳定状态生长 阶段;乳酸杆菌或乳制品加工培养物;在水处理设施中；在真核细胞或器官培养物中；在真 核宿主中；在脊椎生物体中或脊椎生物体上;或在哺乳动物中或哺乳动物上。
[0023] 在一实施方案中，交配对形成系统包括，例如至少一个菌毛接合基因；或另一个可 移动元件转移系统，例如转导或电穿孔。用于引入合适质粒的可选的系统包括基于噬菌体 的DNA递送系统。
[0024] 在其他实施方案中，遗传物质的转移是，例如在至少30°C的温度;在多种菌毛基因 表达的温度。另一个可以变化的条件是转移时间，例如2至12或更多小时，优选地2小时。在 一实施方案中，供体细胞是F+细菌细胞。在另一实施方案中，接受体细胞是F-细菌细胞。在 优选的实施方案中，遗传物质的转移导致包含所述接合型质粒的所述细菌培养物的成员的 增加。在另一优选的实施方案中，供体细胞与接受体细胞的比例在1:1的两个对数单位以 内，例如100:1至1:100。
[0025] 关于将复层病毒·菌体添加到异质细菌培养物，在一实施方案中，对于每一包含 编码所述受体的所述接合型质粒的细菌细胞，即对于每一易感于包括复层病毒的噬菌体感 染的细胞，添加至少10个噬菌体。在一实施方案中，噬菌体减少所述接合型质粒的数量。在 另一实施方案中，噬菌体在宿主细菌中不能复制，例如由于有缺陷的感染、复制或裂解，其 包括不相容性机构，包括包含所述接合型质粒的宿主细胞。在其他实施方案中，噬菌体在包 含所述接合型质粒的宿主细菌中不能复制其基因组。因此，在宿主细菌中有复制能力的噬 菌体不是本发明的方法所需要的。
[0026] -方面，本发明提供在异质细菌培养物内转移赋予对例如复层病毒的菌体附着 的易感性的可移动遗传元件的方法。所述异质细菌培养物包括易感于噬菌体结合的供体细 菌细胞和不易感于噬菌体结合的接受体细菌细胞。遗传元件的转移在合适的条件下发生在 供体细菌细胞与接受体细菌细胞之间。伴随遗传元件转移到接受体细菌细胞，所述接受体 细菌细胞变为易感于噬菌体结合，这通常导致所述接受体细胞的死亡。
[0027] 可移动元件通常是编码例如复层病毒噬菌体受体基因或菌毛基因的质粒。所述质 粒可以选自于以下任何质粒：F、R386、Rl、Col B-K99、Col B-K166、R124、R62、R64、R483、 1?391、1?46、1?724、1^4、1?1(2、1?751、1?卩1010、1?401、1?388或5-3;在111(3群1?或1中 ；或在111(3群0、 M、X、P1、U、C或 J中。
[0028] 易感于复层病毒噬菌体的供体细菌细胞的实例是，例如F+细胞;来自革兰氏阴性 细菌种；来自例如埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属（Pseudomonas)、沙门氏菌属 (Salmonella)、变形杆菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、不动细菌属(Acinetobacter)、芽 胞杆菌属(Bacillus)或微球菌属(Micrococcus)的属。
[0029] 接受体细菌细胞的实例是F-细胞;来自革兰氏阴性细菌种;来自例如埃希氏菌属、 假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细菌属、芽胞杆菌属或微球菌属的属； 或抗生素抗性基因或毒力基因的载体；
[0030] 复层病毒噬菌体的实例包括 PRDl、AP50、Bam35、NSll、PR3、PR4、PR5、PR722、L17S P37-14〇
[0031] 在一实施方案中，所述供体细菌细胞和所述接受体细菌细胞来自不同细菌种或不 同细菌属。
[0032] 在其他实施方案中，方法包括以下步骤:给予例如复层病毒的噬菌体以感染表达 受体的、噬菌体易感的宿主细胞，从而导致异源细菌培养物中所述易感宿主细胞的死亡或 编码抗生素抗性或细菌毒力基因的可移动元件的数量的减少。抗生素也可以伴随噬菌体给 予，例如连续或同时给予。
[0033] -方面，本发明提供重组遗传构建体，其包含编码例如复层病毒的菌体的受体 组分的核酸。所述噬菌体受体组分的表达可以由在宿主细菌细胞中有功能的强异源启动子 驱动。在一优选实施方案中，启动子是诱导型启动子，所述诱导型启动子相比诱导状态，在 诱导状态中可以驱动所述受体基因的表达到至少2、4、5、10或更多倍的更高水平。所述重组 遗传构建体还可以包含连接到编码复层病毒受体的核酸的选择标记。宿主细菌可以是例如 革兰氏阴性细菌。
[0034]另一方面，本发明提供包含可传递的DNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合物， 所述可传递的DNA编码与裂解性噬菌体结合的噬菌体受体，其中所述裂解性噬菌体会杀死 表达所述噬菌体受体的细菌细胞。在某些实施方案中，可传递的DNA是选自N、P、W、D、M、X、 P1、U、W、C或J的Inc质粒；或裂解性噬菌体是命名为PRD1、PRR1、PR3、PR4、PR5、L17、PR772、 GIL01、pGIL01、BAM35或GIL16的噬菌体。还提供了包含具有所述裂解性噬菌体和所述药物 组合物的一个或多个室的试剂盒。
[0035] 本发明提供减少异质细菌群体中编码抗生素抗性和/或毒力因子的接合型质粒的 流行的方法。所述方法包含将所述异质细菌群体与例如复层病毒的噬菌体接触的步骤，所 述噬菌体通过与由所述接合型质粒的核酸组分编码的受体蛋白的相互作用，结合或进入携 带所述接合型质粒的细菌宿主细胞。一旦所述噬菌体已接触并将其基因组插入到所述细菌 宿主细胞中，所述宿主细胞可以表达合适的受体。与该受体结合的噬菌体可以停止或减少 宿主细菌细胞以及其中含有的相关质粒的复制。另一方面，所述方法包括用编码抗生素抗 性和/或毒力因子和噬菌体受体的质粒转化增加比例的细菌群体的步骤。因此，在被适当的 噬菌体感染后，感染性的或致病性的细菌群体可以转变为易感于杀死或增殖减少的细菌群 体。
[0036] 在一实施方案中，异质细菌群体中这些携带质粒的细菌的绝对数量降低例如起始 总数的10%、20%、25%、40%、50%、75%、80%或90%。存在的细菌数量可以通过以下测 定，例如使用血细胞计数器的细胞计数或在合适的培养基上连续稀释，包括在合适的选择 条件下。
[0037] 在另一实施方案中，噬菌体是宽宿主范围噬菌体。宽宿主范围噬菌体的实例包括 噬菌体的复层噬菌体科;质粒依赖性的宽宿主范围噬菌体；以二十面体形态、脂质包含物、 55-65nm直径头部和12-130nm尾部中的至少一个或多个为特征的噬菌体；以及选自以下的 噬菌体 iPRDUPRRUPRS'PRtPRSan'PRTTS'GILOUBamSS'PhiNSllSGILie'APSiKPSS-eS'-eSceSUU-TS'-TTJSTjd-AAcABre'-eA'-TA'-ScSBrUA'-ScISB、-13C、-13L、-14A、-21、-21C、-21T、-26、-26S、-28、-36、-41、-41A、-41B、-43、-45、-50、-50L、-61、61L、-62、-63、-64、-64C、-64L、-64T、-71、-72、-72L、-73、-74、-76、-77、-81、-82、-83、_ 84、-87、-88、P78-76。
[0038] 在另一实施方案中，接合型质粒具有一个或多个以下特征:不相容性群中的成员 资格，例如N、P、W、L/M、T、U、W、Y、B/0、FII、Il、K、com9、FI、HIl、HI2、X、A/C、D、FIV、FV/F0、 FVI、H13、HII、I2、Iga_a、J、V等，包括其例如展现出基本的序列和或功能关系的变体;编码 一种或多种在复层病毒噬菌体复制中重要的其他基因；编码一种或多种抗生素抗性、选择 或毒力标记;是与宿主细菌细胞染色体分离的DNA的形式;或染色体的部分;编码一种或多 种用于细菌接合的菌毛基因。
[0039] 在另一实施方案中，异质细菌群体处于对数或稳定状态生长阶段。所述细菌群体 可以见于多种环境中，例如食物加工单位;或水处理设施中；污水处理厂;医疗单位中；例如 海洋环境、河口水或温泉的环境中。所述细菌群体可以在协同菌落中，其中不同种相互作用 以制造有活力的菌落，正如在生物膜中或白蚁的肠中。在这些菌落中，关键成员的去除可以 去除群体的活力。所述细菌群体可以见于真核细胞或器官培养物中。在其他实施方案中，所 述细菌群体见于，例如真核宿主中；脊椎生物体中或脊椎生物体上;或哺乳动物中或哺乳动 物上。
[0040] 在另一实施方案中，细菌宿主细胞和噬菌体之间的接触发生在细菌细胞表面上的 或例如菌毛的细菌细胞的附器(appendage)上的接合复合物处。所述接合复合物可以与接 合型或可移动质粒相关联。接触还可以通过菌体相关蛋白发生，所述菌体相关蛋白识 别并结合上述接合复合物。对于噬菌体和宿主细菌细胞之间的接触，37°C是优选的温度，尽 管在其他较低或较高的温度接触会发生。用于接触的优选的最适pH是7.0，但是在较高或较 低的pH值下接触会发生。
[0041] 在另一实施方案中，使用能够在有或无噬菌体扩增的多种多重感染下与宿主细菌 细胞结合的噬菌体，发生细