菌宿主细胞和噬菌体的接触。
[0042] 另一方面，本发明提供将可传递遗传元件中编码的噬菌体结合易感性，从易感于 噬菌体结合的供体细菌细胞转移到非易感于所述噬菌体结合的接受体细菌细胞的方法。所 述方法包括在可传递遗传元件被从供体细胞转移到接受体细胞的条件下，将非易感的细菌 细胞暴露于易感的细胞的步骤。
[0043] 在一实施方案中，可传递遗传元件是质粒或染色体片段。所述可传递遗传元件优 选地编码复层病毒噬菌体受体;或菌毛;或细菌接合复合物的组分。在其他实施方案中，可 传递遗传元件是质粒。优选的质粒的实例包括，例如F、R386、R1、Co 1 B-K99、Co 1 B-K166、 尺124、1?62、1?64、1?483、1?391、1?46、1?724、1^4、1?1(2、1?751、1?卩1010、1?401、1?388或5-3。所述质粒 可以在不相容性群（Inc群）中，例如N、P、W、L/M、T、U、W、Y、B/0、FII、Il、K、com9、FI、HIl、HI2、 父、八/(：、0小1￥小￥/^0小￥1、!113、!111、12、18311111^、1和￥，或其变体。噬菌体易感供体可以是，例 如F+细胞;或来自例如埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细 菌属、葡萄球菌属（Staphylococcus )、链球菌属（Streptococcus )、芽胞杆菌属或微球菌属 的属;或抗生素抗性基因或毒力基因的载体。非噬菌体易感的接受体细菌细胞可以是，例如 F-细胞;或来自例如埃希氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、不动细菌 属、葡萄球菌属、链球菌属、芽胞杆菌属或微球菌属的属。如果在本方法中使用复层病毒噬 菌体，优选的复层病毒包括，例如 PRDl、PRRl、PR3、PR4、PR5、L17、PR772、GIL01、Bam35、 PhiNSllSGIL16、AP50、P23-62、-65、-65H、-71、-72、-77、P37-2、-4、-4A、-4B、-6、-6A、-7A、- 8、-8B、-9、-9A、-3、-13B、-13C、-13L、-14A、-21、-21C、-21T、-26、-26S、-28、-36、-41、-41A、_ 41B、-43、-45、-50、-50L、-61、61L、-62、-63、-64、-64C、-64L、-64T、-71、-72、-72L、-73、-74、-76、-77、-81、-82、-83、-84、-87、-88、？78-76。在优选的实施方案中，复层病毒噬菌体易 感细胞的比例在细菌菌落或感染中增加。
[0044] 在另一实施方案中，例如复层病毒的噬菌体被用于感染致使表达受体的细胞，并 且优选地发生以下结果：噬菌体感染导致易感细胞的死亡;在易感细胞群体中编码抗生素 抗性或细菌毒力基因的其他可移动元件的传递减少;抗生素抗性和噬菌体抗性的以及有毒 力的细菌群体减少。
[0045] 在本发明的另一方面，在上述任何方法中，合适的一种或多种抗生素与噬菌体一 起给予。在优选的实施方案中，噬菌体和抗生素的联合给予引起异质细菌群体中的易感细 菌细胞的协同减少或群体中发现的质粒DNA拷贝的数量减少。
[0046] 发明详述
[0047] I 前言
[0048]从世界不同地方分离的噬菌体的特别的群已经被表征为感染携带接合型质粒的 革兰氏阴性细菌。参见Grahn，et al.(2006)〃PRDl:Dissecting the Genome,Structure and Entry〃(PRDl:剖析基因组、结构和进入）in Calendar(ed.)The Bacteriophages(·菌 体）（2d ed.)0xford Univ.Press,ISBN-13:9780195148503。非常相似的分离物也感染革兰 氏阳性宿主细菌。这些密切相关的噬菌体已经被共同划分到复层噬菌体科并且包括，例如 命名为?1?、？1?4、？1?5、？1?772、1^17^?50、吣11和？37-14的噬菌体。在这些噬菌体的各种感兴 趣的特征中的是，复制机构、衣壳构造、主要外壳蛋白折叠和顶点结构十分类似于人类腺病 毒中的那些。这带来了以下提示，这些病毒属于具有先于细菌和真核生命领域分叉的共同 祖先的原始谱系。复层噬菌体科(下文称为复层病毒)的结构特征提示了符合具有功能上适 用于革兰氏阴性和革兰氏阳性宿主细菌两者的结合和感染机构的这些噬菌体的一些潜在 的原理。因此，如所述，涉及宿主结合和感染中高选择性的普通噬菌体生物学法则似乎不适 用于这些特殊的宽宿主范围噬菌体，并且可能不适用于其他的。
[0049] 复层病毒通常具有二十面体外部蛋白衣壳、脂膜双层和病毒DNA基因组。表征最充 分的PRD1噬菌体成员具有宽宿主范围，是供体特异性噬菌体，并且仅感染携带IncP、IncN或 IncW的宿主细胞，所述IncP、IncN或IncW是多抗药性接合型质粒。Inc质粒是"不相容性"群 质粒，其有效地防止相同不相容性群的其他质粒共享宿主，但似乎是噬菌体感染所必需的。 因此，该质粒似乎编码噬菌体感染所必需的一些功能，推测地是噬菌体受体。不同不相容性 群质粒似乎能共存于单一宿主，但是存在防止相同群的多质粒共感染单一宿主的机构。质 粒通常编码噬菌体受体，并赋予宿主细菌噬菌体结合（以及最终感染）易感性。这意味着易 感性可以被转移到最初不易感的宿主细胞。
[0050] 存在很多不同Inc群，群中有一个或多个已描述的质粒。例如，由质粒F和R386所代 表的群F1;由质粒R1所代表的群FII;由质粒Col B-K99和Col B-K166所代表的群Fill;由质 粒R124所代表的群FIV;由质粒R62、R64和R483(至少5个亚群)所代表的群I;由质粒R391所 代表的群J;由质粒R46所代表的群N;由质粒R724所代表的群0;由质粒RP4、RK2和R751所代 表的群P;由质粒RSF1010所代表的群Q;由质粒R401所代表的群T;以及由质粒R388和S-a所 代表的群W。存在具有较少代表的其他相似的群并且随着时间会被鉴定出来。
[0051 ] II.定义
[0052] "细菌培养物"是细胞的群体，其中的一些或全部是细菌。在实验室的情况下，通常 培养物是同质的并且经常是克隆的。在临床的情况下，经常存在"异质细菌培养物"。所述培 养物会经常包括多细菌种，每个细菌种经常含有遗传变体，并且这些可以相互作用并展现 出对集体群体的系统生物学效应。异质细菌培养物可以包括多于一个细菌种。在一些实施 方案中，异质细菌培养物中发现多于2、3、5或10个细菌种。异质细菌培养物的不断变化的方 面可以造成培养物内不同亚群体的相对量和流行的改变以及群体发展的作为结果的指向。 在其他情况下，具体的分离物可以是克隆的，并且某些亚群体可以是不同感染性疾病症状 的病灶或原因。培养物的不同成员可以是克隆的，可以是多克隆的或培养物可以包括混合 种。群体可以具有协同群体组分，其经常形成生物膜结构。参见，例如Talsma(2007)〃 Biofilms on medical devices〃（医学设备上的生物膜)Home Healthc.Nurse 25(9):589-94PMID:18049256;Paju和Scannapieco''Oral Biofilms,periodontitis,and pulmonary infections〃（口腔生物膜、牙周炎和肺感染）0ral Dis. 13(6) :508-512 PMID: 17944664; Visai,et al.(2007)^Staphylococcus biofilm components as targets for vaccines and drugs 〃(葡萄球菌属生物膜组分作为疫苗和药物的祀点）Int.J.Artif. Organs 30(9): 813-819 PMID:17918127;del Pozo和Patel(2007)"The challenge of treating biof i lm-associated bacterial inf ections〃（治疗生物膜相关细菌感染的挑战） Clin.Pharmacol.Ther.82(2):204-209 PMID:17538551;和Ryan(2007)"Infection following soft tissue injury: its role in wound healing〃（软组织损伤后的感染：其 在伤口愈合中的作用）Curr.0pin. Infect.Dis.220(2) :124-128PMID: 17496569,以及普通 临床微生物学教科书。异质细菌培养物包括协同/共生生物培养物，例如生物膜。对于此类 型异质细菌培养物，去除培养物的一个组分可以使所述培养物无法作为整体生存。参见，例 如Colin和Moran(2006)〃Molecular Interactions between Bacterial Symbionts and Their Hosts〃(细菌共生体及其宿主之间的分子相互作用)Cell 126:453-465。
[0053]哺乳动物细菌感染的典型部位和见于感染中的异质细菌培养物的实例在下文列 出。感染的任何部位可以包括至少两个或更多的下文列出的种。
[0054]人/动物肠:埃希氏菌属的种、沙门氏菌属的种、志贺氏菌属(Shigella)的种、假单 胞菌属的种、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)的种和变形菌属的种。
[0055] 人咽喉（以及吸入性肺炎、鼻窦感染、中耳感染等）：葡萄球菌属的种、链球菌属的 种、嗜血杆菌属(Haemophilus)的种、棒状杆菌属（Cornybacterium)的种和奈瑟氏菌属 (Neisseria)的种。
[0056] 皮肤伤口 /烧伤:假单胞菌属的种、葡萄球菌属的种、克雷白氏杆菌属的种。公路事 故伤口感染：主要是土壤生物体+厌氧微生物（梭菌属（Clostridium)的种、拟杆菌属 (bacterioides)的种）。
[0057]见于环境中的异质细菌培养物可以包括至少两个细菌种，包括以下种中的一个： 埃希氏菌属的种、沙门氏菌属的种、志贺氏菌属的种、假单胞菌属的种、克雷白氏杆菌属的 种、变形菌属的种、芽孢杆菌属的种、土壤分支杆菌和链霉菌属（Streptomyces)。此列表不 排除可以存在于群体中的其他类型的细菌种。
[0058]可以存在含有亚类或亚群体的质粒，例如一些细菌可以具有多种不同质粒或其组 合，这可以赋予在某些条件下多种选择性优势。某些质粒可以编码一个或多个抗生素抗性 或毒力基因。Inc群质粒通常用作防止不相容性群的其他质粒共存在相同宿主中。参见，例 如Fernandez-L0pez，et al·(2006)〃Dynamics of the Incff genetic backbone imply general trends in conjugative plasmid evolution〃（IncW基因骨架的动力学暗不接合 型质粒进化中的一般趋势）FEMS Microbiol .Rev· 30(6) :942-66 PMID: 17026718;以及 Adamczyk和Jagura-Burdzy(2003)〃Spread and survival of promiscuous IncP-1 plasmids"(杂IncP-1 质粒的扩散和存活）Acta Biochim. Pol .50(2) :425-53 PMID: 12833168。种中的异质性经常可以反映出不同形式之间选择压力的缺乏或单一优选表型的 不完全选择。
[0059]复层病毒，即复层噬菌体科的成员，是指某些宽宿主范围噬菌体。复层病毒是宽宿 主范围噬菌体的一种形式，而确实存在其他的，并且通过合适的表征或相关选择标准会发 现其他的。分类标准可以基于属或种的成员间共享的结构和功能特征的组合。特别地，存在 其他相似噬菌体，例如丝状噬菌体科（Inoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)和短尾噬 菌体科(Podoviridae)类别的其他相似噬菌体，它们的感染性是质粒依赖性的。特别地，这 些实例包括噬菌体，所述噬菌体的宿主范围是由具有特定质粒的宿主所限定，所述特定质 粒例如编码针对分别的噬菌体的受体。同样地，这些质粒赋予与所述质粒相容的宿主的噬 菌体结合和感染的能力。
[0060]在其他质粒依赖性噬菌体中，包括有：IncP质粒提供对于例如PR64FS和ΙΠ 的某些 丝状噬菌体科噬菌体的易感性。如其他地方所述，IncP、IncN和IncW提供对于例如PRD1、 ?尺4、？1?3、？1?5、？1?772和1^7的某些复层噬菌体科噬菌体的易感性。11?^质粒提供对于某些光 滑噬菌体科或RNA噬菌体的易感性，所述某些光滑噬菌体科或RNA噬菌体包括，例如噬菌体 0;尺687、1?71113、1?77813和1?840 ;质粒编码类似于噬菌体1和？丨1!1€[的结构并且噬菌体附着于菌 毛的侧面和末端。空斑形成表现出一些温度敏感性，经常是较低温度时具有较高的敏感性。 IncM提供对于例如噬菌体Μ的RNA噬菌体的敏感性，并且似乎对很多含有该质粒的生物体有 效。IncX、IncM、IncN、IncPl、IncU、IncW和质粒R775似乎提供对于包括例如噬菌体X和R6K在 内的吸附菌毛尖部的丝状噬菌体的敏感性。IncC提供对于RNA噬菌体的易感性，所述RNA噬 菌体包括例如噬菌体C-1;或包括例如噬菌体C-2在内的丝状噬菌体。IncC、IncD和IncJ提供 对于包括例如噬菌体J在内的长尾噬菌体科(siphoviridae)噬菌体的易感性。Folac质粒提 供对于噬菌体Folac的易感性。IncP质粒还提供对于丝状噬菌体Pf3的易感性(参见Luiten， et al.(1985)J.Virol.56(1)268-276)，并且其中的受体结合节段可以用于靶向于杀死剂， 无论是完整的噬菌体或连接到受体结合结构域的其他活性(参见，例如W0 2007/130655; PCT/US2007/010972)。同样地，IncI或IncN质粒提供对于丝状噬菌体Ike的易感性；并且 111(31、1110~和1110?质粒赋予对于丝状噬菌体12-2的易感性。参见，例如阶 &(1167,6七&1. (1983)J Bact.154(1):505-507。
[0061 ]已述的各种复层菌体(tectiphage)影响不同革兰氏阳性生物，例如Bam35作用 于苏云金芽孢杆菌(B. thuringenesis) ;AP50作用于炭疽杆菌(B.antracis) ;PhiNSl作用于 B.adiocalarius;GIL16和GIL01作用于苏云金芽孢杆菌；以及pBCLIN作用于仙人掌杆菌 (B.cereus)〇
[0062] 宽宿主范围噬菌体会是其宿主范围通常比高特异性的细菌宿主特异性法则更宽 的菌体。参见，例如Bamford，et al.(1995)"Bacteriophage PRDl:a broad host range DSDNA tectivirus with an internal membrane〃（卩策菌体PRD1:具有内膜的宽宿主范围 DSDNA复层病毒）Adv.Virus Res.45:281-319 PMID:7793328;和Saren，et al.(2005)"A snapshot of viral evolution from genome analysis of the tectiviridae family" (来自复层噬菌体科的基因组分析的病毒进化概要）J Mol. Biol. 350(3) :427-40 PMID: 15946683。通常，宽宿主范围噬菌体可以感染很多宿主，所述宿主表达合适的受体分子，但 是可以来自于被归入分歧的属、科或目分类类别的宿主。受体可以在接合型质粒上或其他 地方编码，以便于按照需要提供结合、感染和/或杀死所必需的基因。
[0063] 接合型质粒通常编码其自身细胞间传递所需要的功能，所述细胞间传递优选地通 过接合。在本文使用的情况下，意指编码大部分必需基因的功能，所述功能留下选择或改造 可以弥补质粒自身上失去的组分的构建体的可能性。也存在通过添加或选择已表现出宽宿 主范围的质粒来拓宽质粒的宿主范围的手段，所述已表现出宽宿主范围的质粒包含复制的 低特异性原点或与所需的宿主范围相容的多原点。接合质粒是"可移动元件"的一种形式， 其通常是物理装置，通过该装置实现细菌种和致病型的多样化。例如，多样的移动DNA元件 的侧向基因转移（lateral gene transfer(LGT))可以借助质粒、菌体、转座子和基因组 岛发生。尽管最通常考虑的装置是质粒，但是相似的功能可以通过噬菌体、转座子等中所描 述的原理的类似应用来实现。
[0064] 接合型质粒的减少，无论是绝对数量或宿主细胞中的流行，可以以很多方式实现。 携带大的质粒的选择劣势可以针对具有所述质粒的宿主而选择或造成所述宿主丢失全部 的或部分的质粒。相反，质粒可以赋予例如抗生素抗性的有利表型，并且所有细胞可以具有 所述质粒。在其他情况下，质粒可以编码噬菌体的受体，这使噬菌体成为杀死或去除具有所 述质粒的宿主的装置。在一些实施方案中，接合型质粒是重组质粒，其已被改造以减小其大 小(减少核苷酸总数），但保持接合型质粒的功能，即细胞之间转移的能力和核酸序列的存 在，所述核酸序列在宿主细胞中表达时，编码复层病毒的受体。减少可以是在质粒的绝对数 量、培养物中具有所述质粒的相关宿主的数量或具有所述质粒的宿主的相关部分。
[0065] 交配对形成系统是DNA从一个细胞被转移到另一个细胞所凭借的装置。这区别于 细胞分裂产生两个细胞，而是两个细胞彼此转移一些DNA组分。参见例如，参见例如 Schaechter(2004)The Desk Encyclopedia of Microbiology(微生物学案头百科）（2d ed.)Academic Press，ISBN 0126213615,9780126213614;Funnell和Phillips(eds.2004) Plasmid Biology (质粒生物学）ASM Press , ISBN-10 : 1555812651, ISBN-13 : 978-1555812652；Streips和Yasbin(2003)Modern Microbial Genetics (现代微生物遗传学) (2d ed.)Wiley-IEEE,2003,ISBN 0471461083,9780471461081;Schrodera和Lankab (2005)〃The mating pair formation system of conjugative plasmids-A versatile secretion machinery for transfer of proteins and DNA〃（接合型质粒的交配对形成 系统-用于蛋白和DNA转移的多用途分泌机构）Plasmid 54(1): l_25;Francia，et al. (2004)"A classification scheme for mobilization regions of bacterial plasmids〃(细菌质粒移动区的分类方案)FEMS Microbiol Rev · 28( 1): 79-100;Frost，et al · (1994)''Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor〃(F性因子的转移区的序列和基因产物分析)Microbiol Rev.58(2): 162_210;Novotny，et al·(1969)〃Functions of F Pili in Mating-Pair Formation and Male Bacteriophage Infection Studied by Blending Spectra and Reappearance Kinetics"(通过调和