免疫缺陷小鼠的制作方法

本发明涉及向il-2(白细胞介素2)受体γ链的基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损、且fcgr(iggfc受体)在功能上不表达的基因改造免疫缺陷小鼠、及在该基因改造免疫缺陷小鼠中以显著高的比例植入有人细胞的人细胞植入免疫缺陷小鼠等。

背景技术：

能够在体内对人细胞、人组织进行分析的人源化免疫缺陷小鼠不仅可作为用于开发药品的研究工具进行利用，还作为能够通过移植人细胞从而在体内进行人细胞的分化、功能分析等基础研究的有用工具，而被认为是可期待对于医疗的贡献的实验动物，长年以来一直尝试制备更有用的人源化免疫缺陷小鼠。

例如，伊藤等人在能够植入人细胞、可观察到补体活性、巨噬细胞功能的减弱、自然杀伤(nk)细胞活性的减弱等的nod-scid小鼠中敲除了作为细胞因子受体共通结构域的il-2受体γ链基因，将所得小鼠(il2rγko小鼠)进行回交，从而制备了功能性t细胞及b细胞一同缺失、nk细胞活性消失、巨噬细胞功能减弱、且树突状细胞功能减弱、具有优异的异种细胞植入性的nog小鼠(也表示为“nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1sug/shijic”、“nod-scid，il2rg^null”等)(例如，参见专利文献1)。nog小鼠被认为是人的细胞、组织的植入性非常高的免疫缺陷小鼠。

另一方面，免疫系统中，igg抗体在其结构中包含可变区和恒定区，在可变区中与病原体等异种抗原进行结合。另一方面，在许多免疫细胞的表面，存在与igg抗体的恒定区结合的受体fcgr，与抗原等结合的抗原特异性igg抗体介由其恒定区与fcgr结合。结果，可诱导免疫细胞的活化，排除病原体等异物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3753321号公报

技术实现要素：

发明所要解决的课题

已知向上述的nog小鼠中移植高表达肿瘤相关抗原的人癌细胞、进而施予识别肿瘤相关抗原的igg抗体后，可显著抑制nog小鼠内的人癌的生长，但本申请的发明人确认到，在nog小鼠中，igg抗体介由小鼠fcgr而参与抗体依赖性癌抑制反应，所述反应捕获与该肿瘤相关抗原结合的抗体，并损伤人癌细胞。因此，在实施施予人抗体的抗体医药品的功能评价实验等情况下，存在难以判别对于抗体的免疫应答是来自人免疫细胞的免疫应答、还是来自小鼠免疫细胞的免疫应答的问题。

本发明的课题在于提供能够排除来源于免疫缺陷小鼠的免疫细胞针对人抗体的影响、且人细胞的植入性较之以往而言更高的免疫缺陷小鼠。

用于解决课题的手段

本申请的发明人发现，从nog小鼠中进一步使小鼠fcgr基因缺损时，该小鼠不显示针对肿瘤的抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent-cellular-cytotoxicity：adcc)活性，较之nog小鼠而言，人细胞以显著高的比例植入。此外，确认了向该小鼠中导入人il-15基因，并将人nk细胞植入后，仅人nk细胞成为效应细胞，能够评价adcc活性，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]基因改造免疫缺陷小鼠，其特征在于，向il-2受体γ链基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损，且与t细胞及b细胞的抗原受体基因的重建相关的基因的突变位于双等位基因座，并且fcgr在功能上不表达。

[2]如上述[1]所述的基因改造免疫缺陷小鼠，其特征在于，与t细胞及b细胞的抗原受体基因的重建相关的基因的突变为scid突变或rag突变。

[3]如上述[1]或[2]所述的基因改造免疫缺陷小鼠，其特征在于，所述基因改造免疫缺陷小鼠是nog-fcgrko小鼠。

[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的基因改造免疫缺陷小鼠，其特征在于，fcgr的基因包括fcer1g及fcgr2b。

[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的基因改造免疫缺陷小鼠，其特征在于，所述基因改造免疫缺陷小鼠不显示针对肿瘤的抗体依赖性的细胞毒性活性。

[6]来源于上述[1]～[5]中任一项所述的基因改造免疫缺陷小鼠的组织。

[7]来源于上述[1]～[5]中任一项所述的基因改造免疫缺陷小鼠的体细胞。

[8]来源于上述[1]～[5]中任一项所述的基因改造免疫缺陷小鼠的生殖细胞。

[9]人细胞植入免疫缺陷小鼠，其特征在于，在上述[1]～[5]中任一项所述的基因改造免疫缺陷小鼠中以显著高的比例植入有人细胞。

[10]如上述[9]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠，其特征在于，人细胞为人外周血单核细胞。

[11]植入有来源于上述[9]或[10]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠的人细胞的组织。

[12]来源于上述[9]或[10]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠的人体细胞。

[13]来源于上述[9]或[10]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠的生殖细胞。

[14]基因改造免疫缺陷小鼠(ii)，其是通过将上述[1]～[5]中任一项所述的基因改造免疫缺陷小鼠、与导入了人il-15基因的基因改造免疫缺陷小鼠(i)进行交配而制备成的。

[15]如上述[14]所述的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)，其特征在于，基因改造免疫缺陷小鼠(i)为能扩增·维持人nk细胞的nog-hil-15tg小鼠。

[16]来源于上述[14]或[15]所述的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)的组织。

[17]来源于上述[14]或[15]所述的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)的体细胞。

[18]来源于上述[14]或[15]所述的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)的生殖细胞。

[19]人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)，其特征在于，在上述[14]或[15]所述的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)中以显著高的比例植入有人细胞。

[20]如上述[19]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)，其特征在于，人细胞为人外周血单核细胞。

[21]来源于上述[19]或[20]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)的组织。

[22]来源于上述[19]或[20]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)的体细胞。

[23]来源于上述[19]或[20]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)的生殖细胞。

[24]使用上述[9]或[10]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠，对针对人细胞的抗人细胞表面蛋白分子抗体的活性、作用机制进行评价的方法。

[25]使用上述[14]或[15]所述的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、对人nk细胞的adcc活性进行评价的方法。

[26]使用上述[19]或[20]所述的人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)、对人nk细胞的adcc活性进行评价的方法。

[27]人细胞植入免疫缺陷小鼠(iii)，其特征在于，通过使人免疫细胞和人肿瘤细胞在基因改造免疫缺陷小鼠中共存，从而能够对抗人细胞表面蛋白分子抗体的功能进行评价。

[28]使用人细胞植入免疫缺陷小鼠(iii)、对针对人细胞的抗人细胞表面蛋白分子抗体的功能进行评价的方法。

[29]使用人细胞植入免疫缺陷小鼠(iii)、对针对人免疫细胞的抗人细胞表面蛋白分子抗体的功能进行评价的方法。

发明效果

根据本发明，可提供针对肿瘤不显示来自小鼠细胞的adcc活性、且人细胞植入性显著高的基因改造免疫缺陷小鼠。另外，向该小鼠中移植人造血干细胞并使t细胞等人免疫细胞分化后，进而移植人肿瘤细胞，施予抗人pd-1抗体等作为免疫检测点抑制剂发挥作用的抗人细胞表面蛋白分子抗体时，能够对施予的抗人细胞表面蛋白分子抗体的人肿瘤免疫反应进行评价。此外，向该小鼠的基因组中导入人il-15基因，并将人nk细胞植入，从而能够对以人nk细胞作为效应细胞的adcc活性进行评价。

附图说明

[图1]为显示各小鼠有无表达小鼠cd45(mcd45)⁺白细胞中的小鼠fcgriii/ii(mcd16/32)的图。(b)示出nog小鼠的结果，(c)示出nog-fcgrko/+小鼠的结果，(d)示出nog-fcgrko/ko小鼠的结果。(a)为阴性对照。

[图2]为示出了小鼠cd45(mcd45)⁺白细胞中的mfcgriii及mfcgrii表达细胞的比例的图。

[图3]为示出在施予曲妥珠单抗(人igg抗体)后的mcd45⁺白细胞中的f4/80⁺cd11b⁺单核细胞/巨噬细胞级分中，有无fcgriii/ii(mcd16/32)的表达及人igg抗体的结合的图。(a)示出了nog-fcgrko/+小鼠中的不施予曲妥珠单抗的阴性对照的结果，(b)示出了施予人igg抗体的nog-fcgrko/+小鼠的结果，(c)示出了nog-fcgrko/ko小鼠的结果。

[图4]为示出施予小鼠igg1单克隆抗体(migg1)后的血浆中的小鼠igg抗体的浓度的测定结果的图。(a)示出向nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠分别施予100μg小鼠igg1抗体的情况下的结果，(b)示出向nog-fcgrko/ko小鼠分别施予100μg的情况下的结果，(c)示出向nog-fcgrko/ko小鼠分别施予20μg的情况下的结果。

[图5]为示出将3种人igg抗体药物分别以100μg施予至nog-fcgrko/ko小鼠、nog-fcgrko/+小鼠及/或nog小鼠的腹腔内的情况下的、血浆中的各人igg抗体的浓度的测定结果的图。(a)示出了分别施予利妥昔单抗的情况下的结果，(b)示出了分别施予曲妥珠单抗的情况下的结果，(c)示出了分别施予mogamulizumab的情况下的结果。

[图6]为示出向nog-fcgrko/ko小鼠及nog-fcgrko/+小鼠皮下移植her2阳性胃癌细胞株4-1st后的、肿瘤大小的测定结果的图。(a)示出了将生理盐水(saline)施予至各小鼠的情况下的结果，(b)示出了将曲妥珠单抗(赫赛汀，herceptin)施予至各小鼠的情况下的结果。

[图7]为示出向nog-fcgrko/ko小鼠及nog-fcgrko/+小鼠移植人悬浮型癌细胞株daudi后的、血液中的hcd20⁺daudi细胞的比例的测定结果的图。(a)示出了将pbs施予至nog小鼠、nog-fcgrko/ko小鼠及nog-fcgrko/+小鼠的情况下的结果，(b)示出了将利妥昔单抗施予至nog-fcgrko/ko小鼠及nog-fcgrko/+小鼠的情况下的结果。

[图8]示出向各daudi移植小鼠施予利妥昔单抗或pbs、在daudi移植后第23天剖检的肾脏的照片(a)、及重量的测定结果(b)。

[图9]为示出针对nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠，移植人造血干细胞后的总白细胞中的h(human：人)cd45⁺细胞的比例的图。(a)示出了各雄性小鼠的结果，(b)示出了各雌性小鼠的结果。

[图10]为显示针对移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠的hcd45⁺细胞的详细情况的图。(a)示出了雄性的hcd33⁺髓系细胞的结果，(b)示出了雄性的hcd19⁺b细胞的结果，(c)示出了雄性的hcd3⁺t细胞的结果，(d)示出了雌性的hcd33⁺髓系细胞的结果，(e)示出了雌性的hcd19⁺b细胞的结果，(f)示出了雌性的hcd3⁺t细胞的结果。

[图11]为将移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠剖检，测定了造血器官(骨髓·脾脏·血液)中的hcd45⁺细胞的植入率和植入细胞数量的图。(a)示出了骨髓中的植入率，(b)示出了脾脏中的植入率，(c)示出了血液中的植入率，(d)示出了骨髓中的植入细胞数量，(e)示出了脾脏中的植入细胞数量，(f)示出了血液中的植入细胞数量。

[图12]为将移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠剖检，测定了造血器官(骨髓·脾脏·血液)中的hcd3⁺t细胞、hcd19⁺b细胞、hcd33⁺髓细胞、hcd56⁺nk细胞所占的比例及植入细胞数量的图。(a)示出了骨髓中的各细胞的植入率，(b)示出了脾脏中的各细胞的植入率，(c)示出了血液中的各细胞的植入率，(d)示出了骨髓中的各细胞的细胞数量，(e)示出了脾脏中的各细胞的细胞数量，(f)示出了血液中的各细胞的细胞数量。

[图13]为针对移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠，对t细胞亚群的分化情况进行评价的图。(a)示出了针对脾脏和血液中的cd4⁺t细胞·cd8⁺t细胞·cd4⁺cd8⁺dpt细胞的亚群进行的评价，(b)示出了针对hpd-1的评价。

[图14]为针对移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠，对施予抗人pd-1抗体后的小鼠进行剖检，并使用上述装置利用流式细胞术对骨髓·脾脏·血液的各造血组织中的、包括人t细胞在内的人免疫细胞的增减进行分析的图。(a)示出了骨髓中的hcd45⁺细胞植入率，(b)示出了脾脏中的hcd45⁺细胞植入率，(c)示出了血液中的hcd45⁺细胞植入率，(d)示出了骨髓中的hcd45⁺细胞数量，(e)示出了脾脏中的hcd45⁺细胞数量，(f)示出了血液中的hcd45⁺细胞数量。

[图15]为针对移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠，在施予抗人pd-1抗体后剖检小鼠，对造血器官(骨髓·脾脏·血液)中的hcd3⁺t细胞、hcd19⁺b细胞、hcd33⁺髓细胞、hcd56⁺nk细胞所占的比例及植入细胞数量进行测定的图。(a)示出了骨髓中的各细胞的植入率，(b)示出了脾脏中的各细胞的植入率，(c)示出了血液中的各细胞的植入率，(d)示出了骨髓中的各细胞的细胞数量，(e)示出了脾脏中的各细胞的细胞数量，(f)示出了血液中的各细胞的细胞数量。

[图16]为针对移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠，对施予抗人pd-1抗体后的小鼠进行剖检，针对脾脏组织中的hcd3⁺t细胞、以及t细胞的亚群进行验证的图。(a)示出了针对cd4⁺t细胞·cd8⁺t细胞·cd4⁺cd8⁺dpt细胞的亚群在脾脏中的植入率，(b)示出了针对cd4⁺t细胞·cd8⁺t细胞·cd4⁺cd8⁺dpt细胞的亚群在脾脏中的细胞数量。

[图17]的图显示针对移植了人pbmc(外周血单核细胞)的nog-fcgrko/ko小鼠及nog小鼠，(a)移植2500000个情况下的hcd45⁺细胞的植入率，(b)移植2500000个情况下的hcd45⁺细胞的植入细胞数量，(c)移植1500000个情况下的hcd45⁺细胞的植入率，(d)移植1500000个情况下的hcd45⁺细胞的植入细胞数量。

[图18]示出了在将移植了人pbmc的nog-fcgrko/ko小鼠及nog小鼠剖检的情况下，(a)移植2500000个情况下，hcd3⁺t细胞、hcd19⁺b细胞在hcd45⁺细胞中所占的比例及植入率，(b)移植2500000个情况下，cd4⁺t细胞·cd8⁺t细胞·cd4⁺cd8⁺dpt细胞亚群的植入率，(c)移植1500000个情况下，hcd3⁺t细胞、hcd19⁺b细胞在hcd45⁺细胞中所占的比例及植入率，(d)移植1500000个情况下，cd4⁺t细胞·cd8⁺t细胞·cd4⁺cd8⁺dpt细胞亚群的植入率。

[图19](a)示出了移植了人pbmc的nog小鼠、nog-fcgrko/+小鼠及nog-fcgrko/ko小鼠的hcd3⁺t细胞的流式细胞术的分析结果。(b)为示出了在pbmc移植后施予抗人pd-1抗体的情况下，有无诱导针对人pd-1⁺t细胞的adcc活性的图。

[图20]为示出针对nog-hil-15tg小鼠配种得到的小鼠中的hcd45⁺细胞的植入性(a)及nk细胞的比例(b)的图。

[图21]示出了向各daudi移植hil-15tg小鼠施予利妥昔单抗或pbs，在daudi移植后剖检的肾脏的重量的测定结果。

[图22](a)为示出了向hsc-4移植nog(-fcgr+/+)小鼠施予pbs或纳武单抗(nivolumab)的情况下的结果的图，(b)为示出了向hsc-4移植nog-fcgrko/ko小鼠施予pbs或纳武单抗的情况下的结果的图。

[图23]为示出hsc-4移植后、经过4周，剖检nog-fcgrko/ko小鼠及nog(-fcgr+/+)小鼠，造血器官(脾脏·血液)中及肿瘤中的hcd45+cd3+t细胞的比例(a、b、c)以及细胞数量(d、e、f)的图。(a)示出肿瘤内的hcd3+t细胞的比例，(b)示出脾脏内的hcd3+t细胞的比例，(c)示出血液中的hcd3+t细胞的比例，(d)示出肿瘤内的hcd3+t细胞的植入数量，(e)示出脾脏内的hcd3+t细胞的植入数量，(f)示出血液中的hcd3+t细胞的植入数量。

具体实施方式

作为本发明的基因改造免疫缺陷小鼠，只要是向il-2受体γ链基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损、且fcgr在功能上不表达的小鼠即可，没有特别限定，作为上述基因改造免疫缺陷小鼠，是指针对编码负责特定免疫功能的蛋白质的野生型基因的碱基序列，通过导入突变(将一个或二个以上碱基取代为其他碱基、一个或二个以上碱基的缺失、一个或二个以上碱基的插入、氨基酸的读码框移位的移码(outofframe)及/或它们的组合等)的基因改造而使野生型基因所起到的免疫作用不发挥功能的小鼠。需要说明的是，作为上述野生型，可举出作为群体中最为常见的等位基因或多态性、且未经过突变或基于人工操作的基因改造的小鼠。

本发明还包括通过将上述基因改造免疫缺陷小鼠与向基因改造免疫缺陷小鼠中导入人il-15基因而得到的基因改造免疫缺陷小鼠(i)进行交配而制备的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)。

作为本发明中的小鼠，可举出属于啮齿目鼠科家鼠属的哺乳动物。

作为本发明中的向il-2受体γ链基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损的小鼠，可举出il-2受体γ链在功能上不表达的小鼠。

上述il-2受体在人及小鼠中由被称为α链、β链及γ链的3种蛋白构成是已知的，就上述il-2受体γ链而言，γ链单独不具有与il-2结合的能力，但β链与γ链形成的杂合二聚体成为针对il-2的中亲和性受体，α链、β链与γ链形成的杂合三聚体成为针对il-2的高亲和性受体。

上述il-2为细胞因子之一，作为il-2的作用，可举出通过与存在于细胞表面的il-2受体结合来将il-2的信号从细胞质向核内传递、诱导向t细胞、b细胞的增殖、nk细胞的活化等。因此，作为il-2受体γ链在功能上不表达的情况，可举出通过向il-2受体γ链基因中导入突变来使il-2受体丧失与il-2结合的能力的情况、或不发生信号传递的情况。

作为上述fcgr在功能上不表达的基因改造免疫缺陷小鼠，可举出由于编码fcr的基因的突变、导致fcgr不再作为受体蛋白发挥功能的小鼠。关于fcgr的作为受体蛋白的功能，可举出通过特异性地结合于抗原与igg抗体结合而成的复合体来向细胞内传递信号，本发明的小鼠中，该突变必须位于双等位基因座。

上述fcgr是通常存在于t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫系细胞的表面上的受体蛋白，且基于基因结构的相似性而大致分类为fcgri基因所编码的fcgri(cd64抗原)、fcgrii基因所编码的fcgrii(cd32抗原)、fcgriii基因所编码的fcgriii(cd16抗原)这三种。需要说明的是，fcr共通γ链(也称为fcrg或fcerig)成为fcgri和fcgriii中共通的构成因素。

本发明的小鼠中，与t细胞及b细胞的抗原受体基因的重建相关的基因的突变位于双等位基因座是必须的，例如，作为该突变可举出scid突变或rag突变。上述scid突变是在呈现严重联合免疫缺陷(severecombinedimmuno-deficiency：scid)的小鼠中发现的、dna依赖性蛋白激酶(dna激活的蛋白激酶催化多肽，proteinkinase，dnaactivated，catalyticpolypeptide：prkdc)基因的突变。

作为上述rag突变，可举出rag(重组活化基因，recombinationactivatinggene)-1基因或rag-2基因中的突变。这两个基因是在未成熟淋巴细胞中表达的基因，且具有免疫球蛋白基因及t细胞受体的重建所必需的作用，是对于t细胞、b细胞的成熟而言不可或缺的基因。

在双等位基因座具有以上述scid突变及/或rag突变为代表的、与t细胞及b细胞的抗原受体基因的重建相关的基因的突变的小鼠由于dna的修复异常而无法重建t细胞及b细胞的基因，因此，t细胞和b细胞未到达成熟阶段，是t细胞及b细胞的功能缺失的突变。本发明的小鼠中，所述突变必须均位于双等位基因座。

作为制备本发明的向il-2受体γ链基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损、且fcgr在功能上不表达的基因改造免疫缺陷小鼠的方法，可举出将导入至il-2受体γ链基因的突变、和fcgr基因的突变利用以往已知的基因组编辑方法导入至小鼠的方法、使用以往已知的小鼠进行交配来制备的方法，另外，也可将利用已知的基因组编辑方法导入至小鼠的方法与利用交配的方法进行组合来制备。

作为上述已知的基因组编辑方法，可示例使用类转录激活因子效应物核酸酶的talen系统、锌指核酸酶系统、crispr/cas9(规律成簇间隔短回文重复/crispr相关蛋白，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crisprassociatedproteins)系统等。从能够通过切割dna双链(doublestrandbreaks)并在基因组序列的任意位置删除、取代、插入来编辑基因组，从而将导入至il-2受体γ链基因的突变、fcgr基因的突变导入至小鼠es细胞、小鼠ips细胞中的观点考虑，可举出上述crispr/cas9作为优选的基因改造技术。

作为上述使用以往已知的小鼠进行交配来制备的方法，只要是能制备向il-2受体γ链的基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损、且fcgr(iggfc受体)在功能上不表达的基因改造免疫缺陷小鼠的方法即可，没有特别限定，可示例将向il-2受体γ链基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损的小鼠、与fcgr在功能上不表达的小鼠(fcgrko小鼠)进行交配的方法。需要说明的是，本说明书中，“fcgrko小鼠”表示相对于野生型(+/+)而言，由于双等位基因座的突变导致的功能缺损(ko/ko)使得fcgr的功能不表达，不包括杂合型(ko/+)。

作为上述向il-2受体γ链中导入突变从而il-2受体γ链缺损的小鼠，具体而言，可举出nog小鼠、c57bl/6-il2rg^null小鼠、c57bl/6-rag2^nullil2rg^null小鼠、nod/shi-rag2^nullil2rg^null小鼠、balb/c-rag2^null-il2rg^null小鼠、balb/c-il2rg^null小鼠等已知的小鼠，从在双等位基因座还具有scid突变或rag突变的观点考虑，优选nog小鼠、c57bl/6-rag2^nullil2rg^null小鼠、nod/shi-rag2^nullil2rg^null小鼠、balb/c-rag2^null-il2rg^null小鼠，特别优选t细胞及b细胞的功能缺失、nk细胞的活性消失、巨噬细胞的功能减弱、树突状细胞的功能减弱的nog小鼠。

作为上述fcgr的基因的具体例子，可举出fceri基因、fcgri基因、fcgrii基因、fcgriii基因，作为上述fcgrko小鼠的具体例子，可举出fceri基因缺损的nod-fcer1g^null/null小鼠、fcgrii基因缺损的nod-fcgr2b^null/null小鼠、fcgriii基因缺损的nodiii^-/-小鼠、fceri基因和fcgrii基因缺损的nod-fcer1g^null/nullfcgr2b^null/null小鼠，可优选示例在功能上不表达的fcgr包括fcer1g及fcgr2b的、nod-fcer1g^null/nullfcgr2b^null/null小鼠。

作为利用交配来制备向il-2受体γ链的基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损、且fcgr在功能上不表达的基因改造免疫缺陷小鼠的方法，以下，以下述情况的制备方法为例进行说明：作为il-2受体γ链缺损的小鼠，使用例如nog小鼠，作为fcgr在功能上不表达的小鼠(fcgrko/ko小鼠(基因型)、fcgrko小鼠(表型))，使用了例如不发挥功能的fcgr的基因为fcer1g及fcgr2b的nod-fcer1g^null/nullfcgr2b^null/null小鼠。需要说明的是，由于il-2rg存在于x染色体，因此雄小鼠的基因型为il2rg^null/y、雌小鼠的基因型为il2rg^null/null时，成为il-2rg在双等位基因座中缺损的小鼠。

上述nog小鼠是通过下述方法制备而成的小鼠：将由于与人的1型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)的病况相似而被命名为nod(非肥胖性糖尿病，nonobesediabetes)的小鼠(例如，参见jikkendobutsu.29：1-13，1980)、与由于dna依赖性蛋白激酶(prkdc)基因的突变而导致t细胞及b细胞的功能缺失、呈现严重免疫缺陷的scid小鼠组合，在所得到的nod-scid小鼠中敲除作为免疫缺陷征xscid(x-连锁重症联合免疫缺陷病，x-linkedseverecombinedimmunodeficiency)的致病基因、并且是数种细胞因子受体的共通结构域的il-2受体γ链，将所得到的小鼠(il-2rγko小鼠)(ohbok等，blood1996)按照杂交-互交(crossintercross)法(inbredstrainsinbiomedicalresearch，m.f.w.festing，1979，themacmillanpress，londonandbasingstoke)进行回交，具体而言，可参考日本专利第3753321号公报来进行制备，另外，可从公益财团法人实验动物中央研究所获得。

上述nod-fcer1g^null/nullfcgr2b^null/null小鼠是由东北大学的高井俊行制备的小鼠，保存于国立研究开发法人理化学研究所生物资源研究中心(rikenbrc)，可以以冷冻胚胎或个体复原小鼠的形式获得。

作为使用nog小鼠和nod-fcer1g^null/nullfcgr2b^null/null小鼠的情况下的本发明的基因改造免疫缺陷小鼠的制备方法，可示例依次具有以下的a)～f)的步骤的方法。

a)将雄性的nod-fcerlg^null/nullfcgr2b^null/null小鼠、与雌性的nog小鼠交配的步骤；

b)选择雌性的nod-scid/+，il2rg^null/+-fcer1g^null/+fcgr2b^null/+小鼠的步骤；

c)将b)中选择的小鼠与雄性的nog小鼠回交的步骤；

d)选择雄性的nod-scid，i12rg^null/y-fcer1g^null/+fcgr2b^null/+小鼠、和雌性的nod-scid，i12rg^null/null-fcer1g^null/+fcgr2b^null/+小鼠的步骤；

e)将d)中选择的雄性的小鼠与雌性的小鼠进行兄妹交配的步骤；

f)选择1)雄性的nod-scid，il2rg^null/y-fcerlg^null/null，fcgr2b^null/null、和2)雌性的nod-scid，il2rg^null/null-fcer1g^null/null，fcgr2b^null/null作为“nog-fcgrko/ko小鼠”的步骤；

关于上述制备步骤中的小鼠的各基因型，可通过利用使用了合适的引物的pcr法的常规方法进行确认。

本发明也涉及来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠的组织、体细胞、生殖细胞。

作为来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠的组织，可示例肝脏、脾脏、脑、肾脏、肺、皮肤、膀胱、胃、胆囊、胰腺、肾上腺、前列腺、大肠、小肠、食道、肌肉、乳腺、胸腺、淋巴结、神经、气管、眼球、骨、心脏、脂肪、生殖器(例如卵巢、子宫、睾丸、精囊腺)、胚胎或甲状腺，可优选示例脾脏、骨髓、肝脏。

作为来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠的体细胞，可举出间充质干细胞、造血干细胞、来源于脂肪组织的间质细胞、来源于脂肪组织的间质干细胞、神经干细胞、精子干细胞等组织干细胞、组织前体细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、上皮细胞、淋巴细胞、白细胞、t细胞、b细胞、髓细胞等。

作为来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠的生殖细胞，可举出小鼠的精子、卵子。

作为本发明的小鼠的有利特性，可举出下述特性：介由小鼠fcgr发挥作用的小鼠吞噬细胞针对与癌抗原特异性的人抗体结合的实体肿瘤、悬浮癌细胞(也总称为“肿瘤”)不显示adcc活性，并且，较之以往已知的小鼠而言，人细胞以显著高的比例植入。

作为确认本发明的小鼠是否显示上述的adcc活性的方法，可举出下述方法：向本发明的小鼠和比较对象小鼠各自通过皮下移植等移植人实体癌细胞株，在施予人抗体后适时地测量上述人实体癌细胞株所形成的肿瘤的大小，例如，施予人抗体后约20天左右的本发明的小鼠的肿瘤块的大小(容积)为小鼠fcgr表达的比较对象小鼠中的肿瘤大小的3倍、优选4倍、更优选5倍以上时，可判定为不显示针对上述肿瘤的adcc活性。

作为确认本发明的小鼠是否显示上述adcc活性的其他方法，可举出下述方法：对于本发明的小鼠和比较对象小鼠各自将人悬浮型癌细胞株移植至血液中，在施予人抗体后适时地确认血液中的人悬浮型癌细胞的增殖情况，例如，可举出施予人抗体后约20天左右的本发明的小鼠的总白细胞中的人悬浮型癌细胞的比例为小鼠fcgr表达的比较对象小鼠的总白细胞中的人悬浮型癌细胞的比例的3倍、优选4倍、更优选5倍、进一步优选8倍以上的情况，可判定为不显示针对上述人悬浮型癌细胞的adcc活性。

作为确认本发明的小鼠是否显示上述adcc活性的另一其他方法，可举出下述方法：将人悬浮型癌细胞移植至血液中，针对施予人抗体后的小鼠，测定移植后第23天的癌细胞所集中的组织的重量，与小鼠fcgr表达的比较对象小鼠中的该组织的重量进行比较，本发明的小鼠中的该组织的重量显著重时，判断为不显示adcc活性。例如，可举出施予人抗体后约20天左右的本发明的小鼠中的作为癌细胞所集中的组织之一的肾脏的重量为比较对象小鼠的肾脏的1.5倍、优选1.7倍、更优选为2倍的情况，此时可判定为不显示针对人悬浮型癌细胞的adcc活性。

本发明的小鼠可包括在基因改造免疫缺陷小鼠中以显著高的比例植入有人细胞的人细胞植入免疫缺陷小鼠，所述基因改造免疫缺陷小鼠的特征在于，向il-2受体γ链基因中导入突变从而il-2受体γ链缺损、且fcgr在功能上不表达，作为该小鼠的制作方法，可举出下述方法：为了提高人细胞的植入能力而向人细胞移植前的本发明的基因改造免疫缺陷小鼠照射x射线等破坏骨髓内环境的放射线，在照射放射线后对人细胞进行移植。作为放射的放射线的强度，可优选示例0.5～2.0gy，作为移植的时期，优选照射放射线后24小时以内。需要说明的是，本发明中，作为可移植至本发明的小鼠中的人细胞，可示例人造血干细胞、人外周血单核细胞、人nk细胞。

作为对移植至上述基因改造免疫缺陷小鼠中的人细胞的植入性进行评价的方法，可举出基于具有抗体所结合的特异性表位位点的细胞表面标志物的存在而对小鼠中的人细胞进行鉴定的方法。例如，就外周血的总白细胞中的人白细胞(hcd45⁺细胞)的植入性而言，通过基于使用了抗hcd45抗体的流式细胞术的分析，存在hcd45⁺细胞时，可判断为植入。这是因为，作为人血液细胞的源头的人造血干细胞(hcd34⁺细胞)植入至基因改造免疫缺陷小鼠的情况下，包括白细胞、红细胞、血小板在内的人血液细胞从经植入的人造血干细胞分化、扩增，但作为免疫细胞的白细胞贮留于小鼠的血液中、各免疫组织中。

作为在本发明的小鼠中人细胞(组织)具有显著高的植入性的情况，可举出下述情况：在与nog小鼠进行比较的情况下，基于移植后第16周的双因素方差分析(two-wayanova)(p＜0.05)而显示显著高的人组织的植入性。例如，基于nod-fcer1g^null/nullfcgr2b^null/null小鼠中几乎观察不到人组织的植入性这样的见解，本发明的小鼠较之nog小鼠而言显示出上述高的人组织植入性是本领域技术人员无法预料的效果。

作为上述人细胞为人造血干细胞的情况下的移植人造血干细胞的方法，可举出在向成体小鼠照射x射线后1天以内经由尾静脉移植1000～250000个、优选10000～100000个、更优选25000～75000个hcd34⁺造血干细胞的方法。

作为上述植入人造血干细胞而得到的人细胞植入免疫缺陷小鼠的特征，可举出：脾脏中，显著多地检测到作为向b细胞分化的指标的hcd19⁺细胞的数量，作为显著多的情况，可举出检测到与nog小鼠相比为1.5倍、优选2倍、更优选2.5倍以上的情况。是否存在上述hcd19⁺细胞，可通过例如基于使用了抗hcd19抗体的流式细胞术的分析来确认。

作为上述植入人造血干细胞而得到的小鼠的脾脏的特征，可举出：从hcd3⁺t细胞进一步正常地分化为hcd4⁺t细胞、hcd8⁺t细胞、hcd4⁺cd8⁺双阳性(doublepositive：dp)t细胞的亚群，血液免疫系统得到重建。并且，上述分化的hcd4⁺t细胞、hcd8⁺t细胞、hcd4⁺cd8⁺双阳性(doublepositive：dp)t细胞中，在人t细胞中表达的programmedcelldeath1(pd-1)蛋白分子(hpd-1)得以表达。是否存在上述hcd3⁺t细胞、hcd4⁺t细胞、hcd8⁺t细胞、hcd4⁺cd8⁺双阳性t细胞、hcd19⁺细胞、pd-1⁺细胞，可通过例如基于使用了一系列抗体的流式细胞术的分析来确认。

作为上述人细胞为人外周血单核细胞的情况下的、移植人外周血单核细胞的方法，可举出经由尾静脉移植100000～1×10⁷个、优选500000～5000000个、优选1000000～3000000个、更优选1250000～2750000个、进一步优选1300000～2500000个、特别优选1450000～1750000个的人外周血单核细胞的方法。

作为植入人外周血单核细胞而得到的小鼠，可举出下述情况的人细胞植入免疫缺陷小鼠：在移植人外周血单核细胞后第6周，hcd45阳性的白细胞(hcd45⁺细胞)的植入细胞数量为nog小鼠中的植入细胞数量的2倍、优选3倍、更优选5倍、进一步优选10倍；移植人外周血单核细胞后第6周的人外周血单核细胞中的hcd45⁺细胞的比例为1％以上、优选2％以上、更优选4％以上、进一步优选5％以上、特别优选6％以上，及/或，hcd3⁺t细胞占据hcd45⁺细胞的80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上；人细胞以显著高的比例植入。

如上所述，通过对被移植至基因改造免疫缺陷小鼠中的人细胞的植入性进行评价，可使用上述人细胞植入免疫缺陷小鼠，对针对人细胞的抗人细胞表面蛋白分子抗体的活性、作用机制进行评价。

本发明也涉及来源于上述人细胞植入免疫缺陷小鼠的组织、体细胞、生殖细胞。上述针对人细胞的抗人细胞表面蛋白分子抗体的活性、作用机制的评价也可使用来源于该人细胞植入免疫缺陷小鼠的组织、体细胞、生殖细胞来进行。

作为来源于上述人细胞植入免疫缺陷小鼠的组织，可示例肝脏、脾脏、脑、肾脏、肺、皮肤、膀胱、胃、胆囊、胰腺、肾上腺、前列腺、大肠、小肠、食道、肌肉、乳腺、胸腺、淋巴结、神经、气管、眼球、骨、心脏、脂肪、生殖器(例如卵巢、子宫、睾丸、精囊腺)、胚胎或甲状腺，可优选示例脾脏、骨髓、肝脏。

作为来源于上述人细胞植入免疫缺陷小鼠的体细胞，可举出间充质干细胞、造血干细胞、来源于脂肪组织的间质细胞、来源于脂肪组织的间质干细胞、神经干细胞、精子干细胞等组织干细胞、组织前体细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、上皮细胞、淋巴细胞、白细胞、t细胞、b细胞、髓细胞等。

作为来源于上述人细胞植入免疫缺陷小鼠的生殖细胞，可举出小鼠的精子、卵子。

作为前述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)，只要是通过将本发明的基因改造免疫缺陷小鼠、与导入人il-15基因而得到的基因改造免疫缺陷小鼠(i)进行交配来制备的基因改造免疫缺陷小鼠(ii)即可，没有特别限定，作为导入人il-15基因而得到的基因改造免疫缺陷小鼠(i)，可具体举出向nog小鼠中导入人il-15基因而得到的nog-hil-15tg小鼠(也称为“nod-scid，il-2rγ^null-hil-15tg小鼠”)(例如，参见日本特开2016-220559公报)。另外，作为人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)，可举出在上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)中植入有以人外周血单核细胞、人nk细胞为代表的人细胞的小鼠。本发明的小鼠也可包括该基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)。

作为向上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)中移植人nk细胞而得到的人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)，期望检测到hcd56⁺细胞为植入的hcd45⁺细胞的60％以上、优选70％以上、更优选80％以上的小鼠，作为基因改造免疫缺陷小鼠(ii)，可优选示例nog-fcgrko/kohil-15tg小鼠。是否存在上述hcd56⁺细胞可通过例如基于使用了抗hcd56抗体的流式细胞术的分析来确认。

上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)中，不受小鼠吞噬细胞的影响，仅人nk细胞成为效应细胞，可对adcc活性进行评价。

即，上述人nk细胞成为效应细胞的、上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)中，介由小鼠fcgr发挥作用的小鼠吞噬细胞不显示针对与癌抗原特异性的人抗体结合的肿瘤的adcc活性。因此，使用基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)，可实施针对肿瘤的抗体药物的候选药剂的筛选。

例如，向基因改造免疫缺陷小鼠(ii)中移植人癌细胞后，通过施予人nk细胞、和作为抗体药物的候选药剂的癌抗原特异性的人抗体，可对仅人nk细胞为效应细胞的情况下的针对人癌细胞的adcc活性进行评价。具体而言，向基因改造免疫缺陷小鼠(ii)中移植人癌细胞后，施予人nk细胞和上述候选药剂，癌细胞所集中的组织的重量增加得到抑制时，可判定为该候选药剂具有针对癌细胞的抑制效果。基于同样的判定基准，向植入有nk细胞的人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)中移植人癌细胞后，施予癌抗原特异性的人抗体作为抗体药物的候选药剂，从而可实施仅人nk细胞为效应细胞的情况下的针对人癌细胞的adcc活性评价、上述候选药剂的筛选。

另外，本发明也涉及来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)的组织、体细胞、生殖细胞。上述候选药剂的筛选也可使用该组织、体细胞、生殖细胞来实施。

作为来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)的组织，可示例肝脏、脾脏、脑、肾脏、肺、皮肤、膀胱、胃、胆囊、胰腺肾上腺、前列腺、大肠、小肠、食道、肌肉、乳腺、胸腺、淋巴结、神经、气管、眼球、骨、心脏、脂肪、生殖器(例如卵巢、子宫、睾丸、精囊腺)、胚胎或甲状腺，可优选示例脾脏、骨髓、肝脏。

作为来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)的体细胞，可举出间充质干细胞、造血干细胞、来源于脂肪组织的间质细胞、来源于脂肪组织的间质干细胞、神经干细胞、精子干细胞等组织干细胞、组织前体细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、上皮细胞、淋巴细胞、血液细胞、及由这些细胞分化的nk细胞、t细胞、b细胞、髓细胞等。

作为来源于上述基因改造免疫缺陷小鼠(ii)、人细胞植入免疫缺陷小鼠(ii)的生殖细胞，可举出精子、卵子。

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例

[实施例1]

[nog-fcgrko/ko小鼠的制备]

自实验动物中央研究所获得nog小鼠。经由rikenbrc获得nod-fcer1g^null/nullfcgr2b^null/null小鼠(nod-fcgrko/ko小鼠)的冷冻保存胚胎(rbrc02330)。

(nog-fcgrko/ko小鼠的制备步骤)

通过以下的步骤，从上述nog小鼠和上述nod-fcer1g^nullfcgr2b^null小鼠制备nog-fcgrko/ko小鼠。

(1)(第0代(f＝0)～第1代(f＝1)

通过将从冷冻保存胚胎个体恢复得到的雄性的nod-fcgrko/ko小鼠与雌性的nog小鼠交配，得到4只雌性的nod-scid/+，il2rg^null/+-fcer1g^null/+fcgr2b^null/+小鼠(f＝1)。

(2)(第1代～第2代)

针对该4只雌性小鼠中的每一只，与nog小鼠回交，得到2只雄性的nod-scid，il2rg^null/y-fcer1g^null/+fcgr2b^null/+小鼠、2只雌性的nod-scid，il2rg^null/null-fcer1g^null/+fcgr2b^null/+小鼠(以下总称为“nog-fcgrko/+小鼠(基因型)”)。

(3)(第2代～第3代))

将该nog-fcgrko/+小鼠彼此进行兄妹交配，选择雄性的nod-scid，il2rg^null/y-fcer1g^null/null，fcgr2b^null/null、和雌性的nod-scid，il2rg^null/null-fcer1g^null/null，fcgr2b^null/null，得到“nog-fcgrko/ko小鼠(基因型)、nog-fcgrko小鼠(表型)”。

就上述各步骤中的、小鼠的基因检测而言，向小鼠的组织片添加100μg/ml的含有蛋白激酶k的裂解缓冲液，于55℃使其溶解后，于85℃加热而配制组织溶解液，使用所述组织溶解液，针对各基因，使用以下的引物通过pcr法进行测定，由此验证了是野生型、杂合缺损型、或纯合缺损型等。

(1)fcer1g检测用引物

5’-ctcgtgctttacggtatcgcc-3’(序列号1)(fcer1g检测用引物1)

5’-cctactctactgtcgactcaag-3’(序列号2)(fcer1g检测用引物2)

5’-ggctggctatagctgcctttc-3’(序列号3)(fcer1g检测用引物3)

(fcer1g检测用pcr反应液)

12.5μlgo-taq用×2缓冲液

1.0μlfcer1g检测用引物1(5μm)

1.0μlfcer1g检测用引物2(5μm)

1.0μlfcer1g检测用引物3(5μm)

8.0μl蒸馏水

1.5μl基因组dna(组织溶解液)

将上述的试剂混合，配制pcr反应液。

(pcr扩增条件)

使用25μl的上述pcr反应液，在下述条件下实施扩增处理：于94℃加热处理3分钟；以于94℃30秒、于63℃30秒、于72℃1分钟作为1个循环，实施35个循环；然后于72℃加热处理3分钟。将利用上述pcr得到的pcr产物在2％琼脂糖凝胶中供于电泳，对目标条带大小附近的扩增产物条带的有无进行确认，由此判定各小鼠中的靶基因是野生型还是ko型。即，上述pcr产物的大小为240bp则判定为fcer1gko，大小为198bp则判定为fcer1g野生型(wildtype)(+)。

(2)fcgr2b检测用引物

5’-ctcgtgctttacggtatcgcc-3’(序列号4)(fcgr2b检测用引物1)

5’-aaactcgaccccccgtggatc-3’(序列号5)(fcgr2b检测用引物2)

5’-ttgactgtggccttaaacgtgtag-3’(序列号6)(fcgr2b检测用引物3)

(fcgr2b检测用pcr反应液)

12.5μlgo-taq用×2缓冲液

1.0μlfcgr2b检测用引物1(5μm)

1.0μlfcgr2b检测用引物2(5μm)

1.0μlfcgr2b检测用引物3(5μm)

8.0μl蒸馏水

1.5μl基因组dna(组织溶解液)

将上述试剂混合，配制pcr反应液。

(pcr扩增条件)

使用25μl的上述pcr反应液，在下述条件下实施扩增处理：于94℃加热处理3分钟；以于94℃30秒、于63℃30秒、于72℃1分钟作为1个循环，实施35个循环；然后于72℃加热处理3分钟。将利用上述pcr得到的pcr产物在2％琼脂糖凝胶中供于电泳，对目标条带大小附近的扩增产物条带的有无进行确认，由此判定各小鼠中的靶基因是野生型还是ko型。即，上述pcr产物的大小为232bp则判定为fcgr2bko，大小为161bp则判定为fcgr2b野生型(+)。

(3)il-2rg检测用引物

5’-ctgctcagaatgcctccaattcc-3’(序列号7)(il-2rg检测用引物1)

5’-cctccgtgcaatccatcttgttcaat-3’(序列号8)(il-2rg检测用引物2)

5’-gatccagattgccaaggtgagtag-3’(序列号9)(il-2rg检测用引物3)

(il-2rg检测用pcr反应液)

7.5μlpcr缓冲液(含dntp，mgcl2)×2缓冲液

0.15μlil-2rg检测用引物1(20μm)

0.15μlil-2rg检测用引物2(20μm)

0.15μlil-2rg检测用引物3(20μm)

0.3μltksgflexdna聚合酶(1.25u/μl)

5.25μl蒸馏水

1.5μl基因组dna(组织溶解液)

将上述试剂混合，配制pcr反应液。

(pcr扩增条件)

使用25μl的上述pcr反应液，在下述条件下实施扩增处理：于94℃加热处理3分钟；以于98℃10秒、于65℃15秒、于68℃30秒作为1个循环，实施30个循环；然后于68℃加热处理3分钟。将利用上述pcr得到的pcr产物在2％琼脂糖凝胶中供于电泳，对目标条带大小附近的扩增产物条带的有无进行确认，由此判定各小鼠中的靶基因是野生型还是ko型。即，上述pcr产物的大小为340bp则判定为il-2rgko，大小为660bp则判定为il-2rg野生型(+)。

(4)scid检测用引物

5’-gctagagagctgttccagtt-3’(序列号10)(scid检测用引物1)

5’-tttgaacacacactgattctg-3’(序列号11)(scid检测引物2)

5’-acgctaagc-3’(序列号12)(scid检测用引物3)

5’-cgctatgct-3’(序列号13)(scid检测用引物4)

(scid检测用pcr反应液)

5.0μlcycleavepcrreactionmix×2缓冲液

0.2μlscid检测用引物1(10μm)

0.2μlscid检测用引物2(10μm)

0.4μlscid检测用引物3(5μm)

0.4μlscid检测用引物4(5μm)

0.2μlroxreferencedyeii(50×)

3.1μl蒸馏水

0.5μl基因组dna(组织溶解液)

将上述试剂混合，配制pcr反应液。

(pcr扩增条件)

使用10μl的上述pcr反应液，实施了多重实时pcr分析(multiplexreal-timepcrassay)。在下述条件下实施扩增处理：于95℃加热处理10秒；以于95℃5秒、于55℃10秒、于72℃31秒作为1个循环，实施45个循环。根据扩增反应的循环阈值(ct))的值，将该scid检测用引物1·2·3组合而实施实时pcr时，确认到扩增反应的情况判定为存在scid突变，将scid检测用引物1·2·4组合而实施实时pcr时，确认到扩增反应的情况判定为不存在scid突变(野生型(+))。

[实施例2]

[nog-fcgrko/ko小鼠的特性]

(igg抗体受体fcgr的缺损)

针对上述制备的nog-fcgrko/ko小鼠中fcgr分子的表达是否消失进行了验证。采集nog-fcgrko/ko小鼠的外周血，使其在红细胞溶血反应液中反应而除去红细胞，由此得到白细胞级分。将该白细胞级分使用以下所示的荧光色素标记抗原特异抗体进行抗体染色后，利用流式细胞仪(装置名称：bdlsrfortessa^tmx-20、bectondickinson公司制)来测定荧光强度，由此验证了小鼠cd45(mcd45)⁺白细胞中的、小鼠fcgriii/ii(mcd16/32)的有无、及mfceri分子的表达及mcd45⁺白细胞中的比例。针对上述nog-fcgrko/+小鼠及nog小鼠也实施同样的实验，作为比较对象。结果示于图1及图2。

此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体及用于抑制抗体的非特异结合的fcgr封闭抗体如下。

pe/cy7标记抗小鼠cd16/32(fcgriii/ii)抗体(biolegend公司)、

apc/cy7标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

(结果)

以下，在实施例的记载、附图中，有时将nog小鼠表示为“+/+”；将nod-scid，il2rg^null-fcer1g^null/+fcgr2b^null/+(nog-fcgrko/+)小鼠表示为“ko/+”；将nod-scid，il2rg^null-fcer1g^null/null，fcgr2b^null/null(nog-fcgrko/ko)小鼠表示为“ko/ko”。

由图1可见，在nog-fcgrko/ko小鼠(ko/ko)(图1(d))中，mcd45⁺白细胞中的mfcgriii、mfcgrii消失。另一方面，确认在nog小鼠(图1(b))及nog-fcgrko/+小鼠(图1(c))中，mfcgriii及mfcgrii表达。图2中也示出了同样的结果。

[实施例3]

(人igg抗体结合能力)

在nog-fcgrko/ko小鼠中，验证了与人igg抗体结合的能力是否由于fcgr分子的表达消失而消失。向nog-fcgrko/ko小鼠腹腔内施予人igg型抗体药物曲妥珠单抗100μg后，在第3天采集外周血，通过与实施例2同样的方法得到白细胞级分。将该白细胞级分使用以下所示的荧光色素标记抗原特异抗体进行抗体染色后，使用前述装置利用流式细胞术来测定荧光强度，由此验证了mcd45⁺白细胞中的f4/80⁺cd11b⁺单核细胞/巨噬细胞级分中有无fcgriii/ii(mcd16/32)的表达及人igg抗体的结合。针对上述nog-fcgrko/+小鼠也实施同样的实验，作为比较对象。此外，将不对nog-fcgrko/+小鼠施予上述人igg型抗体药物的情况作为阴性对照。结果示于图3。

此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下所示。

alexafluor488标记人iggfc抗体(biolegend公司)、

pe标记抗小鼠cd11b抗体(biolegend公司)、

pe/cy7标记抗小鼠cd16/32(fcgriii/ii)抗体(biolegend公司)、

apc标记抗小鼠f4/80抗体(ebioscience公司)

apc/cy7标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

(结果)

由图3(c)可见，人抗体施予nog-fcgrko/ko小鼠中，mcd45⁺白细胞中的f4/80⁺cd11b⁺单核细胞/巨噬细胞级分中，未检测出人fcgriii/ii的阳性级分及人igg抗体，未确认到人igg与小鼠fcgr的结合。另一方面，由图3(b)可见，人igg抗体施予nog-fcgrko/+小鼠中，mcd45⁺f4/80⁺cd11b⁺单核细胞/巨噬细胞级分中，在fcgriii/ii为阳性的细胞中检测到人igg⁺的级分，确认到施予的人igg与小鼠fcgr结合。另一方面，阴性对照中，fcgriii/ii为阳性，但未检测出人igg抗体(图3(a))。根据以上，确认到nog-fcgrko/ko小鼠中，针对人igg型抗体的抗体结合能力丧失。

[实施例4]

(小鼠抗体代谢能力)

对上述nog-fcgrko/ko小鼠中，小鼠抗体的代谢能力是否由于fcgr分子的缺损而变化进行了验证。对于nog-fcgrko/ko小鼠，向小鼠的腹腔内施予小鼠igg1单克隆抗体(migg1，克隆mopc-21)100μg或20μg后，在12周期间经时性地采集血液，得到血浆级分。使用小鼠iggelisaquantitationset(bethyllaboratories，inc公司制)，利用elisa法对得到的血浆中的小鼠igg抗体的浓度进行测定。针对nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠也实施同样的实验，作为比较对象。结果示于图4。

(结果)

由图4(b)可见，向nog-fcgrko/ko小鼠施予小鼠igg1抗体100μg的情况下，小鼠igg1抗体于施予后第1周在血浆中的浓度达到最大值，然后渐渐减少，但在第12周也能检测到该抗体。在与nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠进行比较的情况下，也未观察到抗体浓度的差异(图4(a))。因此，确认了nog-fcgrko/ko小鼠中的fcgr分子的缺损对小鼠抗体的代谢速度不产生影响。另外，仅着眼于nog-fcgrko/ko小鼠、将小鼠igg1的100μg施予组与20μg施予组进行比较时，20μg施予组的血浆中的抗体浓度为更低的值，由此确认了血浆中的小鼠igg浓度依赖于抗体施予量(图4(c))。

[实施例5]

(人抗体代谢能力)

对上述nog-fcgrko/ko小鼠中，人抗体的代谢能力是否由于fcgr分子的缺损而变化进行了验证。向nog-fcgrko/ko小鼠的腹腔内分别施予100μg的以下3种人igg单克隆抗体的市售抗体药物，在28天期间经时性地采集血液，得到血浆级分。使用humaniggelisaquantitationset(bethyllaboratories，inc公司制)，利用elisa法对得到的血浆中的各人igg抗体的浓度进行测定。针对nog-fcgrko/+小鼠及nog小鼠也实施同样的实验，作为比较对象。结果示于图5。

此处使用的抗体药物如下。

利妥昔单抗(rituximab)：抗cd20单克隆抗体：美罗华(rituxan)(中外制药株式会社制)；

曲妥珠单抗(trastuzumab)：抗her2人源化单克隆抗体赫赛汀(herceptin)(her2特异性抗体医药品)(中外制药株式会社制)；

mogamulizumab：人源化抗ccr4单克隆抗体poteligeo(协和发酵麒麟株式会社制)；

(结果)

由图5(a)～(c)可见，向nog-fcgrko/ko小鼠分别以100μg施予上述3种人单克隆抗体的情况下，每种人igg抗体均在施予后2周以内大体消失。nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠中，针对上述3种抗体也均观察到相同的趋势。因此，确认了nog-fcgrko/ko小鼠中的fcgr缺损对人抗体的代谢速度也不产生影响。

[实施例6]

(介由小鼠吞噬细胞的adcc活性的消失(1))

已知施予至nog小鼠的抗原特异性抗体介由小鼠fcgr被小鼠吞噬细胞识别，而诱导吞噬反应。因此，使用人实体癌细胞株，在nog-fcgrko/ko小鼠中，验证了介由小鼠吞噬细胞的adcc活性是否由于小鼠fcgr缺损而消失。

将作为人实体癌细胞株之一的her2阳性胃癌细胞株4-1st的3mm见方的肿瘤块，皮下移植至nog-fcgrko/ko小鼠，由此制备了4-1st皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠。针对nog-fcgrko/+小鼠也实施同样的处理，制备4-1st皮下移植nog-fcgrko/+小鼠，作为比较对象。自移植4-1st后第一周起，向上述各4-1st皮下移植小鼠以每周2次腹腔内施予50μg的曲妥珠单抗，在22天期间经时性地测定肿瘤大小。另外，将施予pbs代替抗体的上述2种小鼠作为pbs施予对照组。结果示于图6。

(结果1)

由图6(b)可见，4-1st皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠中，施予曲妥珠单抗的情况下，第22天的肿瘤大小为平均850mm³。另一方面，4-1st皮下移植nog-fcgrko/+小鼠中，施予曲妥珠单抗的情况下，第22天的肿瘤大小为平均150mm³，较之4-1st皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠而言，确认到由曲妥珠单抗抗体施予带来的肿瘤抑制效果。该结果表明，介由小鼠fcgr发挥作用的小鼠吞噬细胞识别并损伤与癌抗原特异性的人抗体结合的肿瘤(人实体癌)，抑制肿瘤块的生长，另外，nog-fcgrko/ko小鼠中未引发介由小鼠吞噬细胞的adcc活性。

(结果2)

由图6(a)可见，pbs施予对照组(saline)中，在4-1st皮下移植nog-fcgrko/+小鼠与4-1st皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠之间未观察到肿瘤块的生长程度的差异，确认了小鼠fcgr的有无对肿瘤的生长程度不造成影响。

[实施例7]

(介由小鼠吞噬细胞的adcc活性的消失(2))

使用人悬浮型癌细胞株，对nog-fcgrko/ko小鼠中，介由小鼠吞噬细胞的adcc活性是否由于小鼠fcgr缺损而消失进行了验证。将作为人悬浮型癌细胞株之一的cd20⁺伯基特淋巴瘤株daudi、以2.4×10⁶个经由nog-fcgrko/ko小鼠的尾静脉移植，制备了daudi移植nog-fcgrko/ko小鼠。针对nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠也实施同样的处理，制备daudi移植nog小鼠及daudi移植nog-fcgrko/+小鼠，作为比较对象。

向上述各小鼠经由尾静脉以每周1次腹腔内施予抗原特异性抗体医药品利妥昔单抗50μg，定期采血，在抗体染色后利用流式细胞术测定血液中的cd20⁺daudi细胞。另外，施予pbs代替抗体至上述各小鼠，作为pbs施予对照组。移植后第21天的结果示于图7。

(结果)

由图7(b)可见，施予了利妥昔单抗的daudi移植nog-fcgrko/ko小鼠中，血液中的cd20⁺daudi细胞的检出比例为总白细胞的1～2％。另一方面，施予了利妥昔单抗的daudi移植nog-fcgrko/+小鼠中，血液中的cd20⁺daudi细胞减少至总白细胞的0.2％以下。另一方面，由图7(a)可见，在pbs施予对照组中，daudi移植nog-fcgrko/ko小鼠、daudi移植nog-fcgrko/+小鼠及daudi移植nog小鼠中的任一组的血液中的cd20⁺daudi细胞的检出频率均为总白细胞的约1.5％～约4％。

[实施例8]

(介由小鼠吞噬细胞的adcc活性的消失(3))

针对上述施予利妥昔单抗或pbs的daudi移植nog-fcgrko/ko小鼠、daudi移植nog-fcgrko/+小鼠、及daudi移植nog小鼠，在daudi移植后第23天剖检，摘出daudi细胞聚集的肾脏，测定器官重量，由此对小鼠吞噬细胞的adcc活性是否发挥功能进行评价。关于结果，各小鼠的肾脏的照片示于图8(a)，各小鼠的肾脏的重量的图示于图8(b)。

(结果)

由图8(a)及(b)可见，利妥昔单抗施予组(rit.)中，daudi移植nog-fcgrko/ko小鼠中，肾脏的重量增加至o.5g左右。另一方面，daudi移植nog-fcgrko/+小鼠中，肾脏的重量为0.2g左右，肾脏的肥大化得到了抑制。pbs施予对照组中，daudi移植nog-fcgrko/+小鼠、daudi移植nog-fcgrko/ko小鼠的肾脏的重量均增加至0.5g左右。另外，daudi移植nog小鼠的肾脏的重量增加至0.57g左右，均观察到daudi聚集导致的肾脏的肥大化。需要说明的是，已知成体nog小鼠的肾脏一般为0.2g左右。以上的结果表明，即使施予抗原特异抗体利妥昔单抗，nog-fcgrko/ko小鼠中，小鼠吞噬细胞也无法介由小鼠fcgr而识别·攻击癌细胞daudi细胞。

(关于adcc活性的总结)

实施例6～8的结果表明，nog-fcgrko/ko小鼠中，由于缺损小鼠fcgr，因此小鼠吞噬细胞的adcc活性不发挥功能。

[实施例9]

(人造血干细胞植入能力的验证1)

对nog-fcgrko/ko小鼠的人造血干细胞的植入能力进行了验证。

(人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠的制备)

向7周龄以上的成体nog-fcgrko/ko小鼠照射x射线，由此对骨髓进行抑制(day0)。在照射x射线后1天以内经由尾静脉移植50000个hcd34⁺人造血干细胞，由此制备了人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠。针对nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠也实施与上述同样的制备处理，由此制备人造血干细胞移植nog小鼠及人造血干细胞移植nog-fcgrko/+小鼠，作为比较对象。

(基于流式细胞术的验证)

针对上述各小鼠，在人造血干细胞移植后经过4周、8周、12周、16周及20周时采集外周血，通过与实施例2同样的方法得到白细胞级分。此外，将该白细胞级分使用以下所示的荧光色素标记抗原特异抗体进行抗体染色后，利用流式细胞术测定荧光强度，由此测定人免疫细胞hcd45⁺细胞的比例。结果示于图9。

需要说明的是，实施例9～实施例12中使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下。

buv395标记抗hcd33抗体(bectondickinson公司)

brilliantviolet421标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd19抗体(biolegend公司)

ape/r700标记抗hcd56抗体(bectondickinson公司)

apc/cy7标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

brilliantviolet51o标记抗hcd45抗体(biolegend公司)

(结果)

由图9(a)及(b)可见，人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠、人造血干细胞移植nog小鼠、及人造血干细胞移植nog-fcgrko/+小鼠的雄性(a)、雌性(b)中，总白细胞中的hcd45⁺细胞的比例均伴随时间的经过而增加，确认了hcd45⁺细胞的植入。在人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠中，hcd45⁺细胞的植入率在8～16周的期间显著大于作为比较对象的小鼠，另外，人造血干细胞移植后经过20周时显示75％左右的值，示出了显著高于作为比较对象的小鼠的值。另一方面，nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠中，即使在人造血干细胞移植后经过20周时，hcd45⁺细胞的比例也止于60％左右的值。

[实施例10]

(人造血干细胞植入能力的验证2)

针对上述人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠、人造血干细胞移植nog小鼠、及人造血干细胞移植nog-fcgrko/+小鼠，调查了总白细胞中的hcd45⁺细胞在人造血干细胞移植后第4周至20周时的详细情况。结果示于图10。

(结果)

由图10可见，上述各小鼠中，分别检测出hcd33⁺髓系细胞(雄性(a)、雌性(d))、hcd19⁺b细胞(雄性(b)、雌性(e))、hcd3⁺t细胞(雄性(c)、雌性(f))的级分。因此，确认了即使小鼠fcgr缺损，对人免疫细胞的分化能力也不产生影响。

[实施例11]

(人造血干细胞植入能力的验证3)

针对上述移植了人造血干细胞的、nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠，在人造血干细胞移植后第26周时剖检，利用流式细胞术测定荧光强度，由此调查hcd45⁺细胞以何种程度植入至造血器官(骨髓·脾脏·血液)中。结果示于图11。

(结果)

由图11(a)～(f)可见，在人造血干细胞移植后第26周时，在移植了人造血干细胞的nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠之间，都未观察到骨髓(bm)((a)(d))·脾脏(spl)((b)(e))·血液(pb)((c)(f))中的hcd45⁺细胞的比例(mnc中的人cd45⁺，humancd45⁺inmnc(％))、及细胞数量(绝对细胞数量，abs.cellnumber(×10⁶个细胞)或绝对细胞数量(×10³个细胞/μl))有显著性差异。

[实施例12]

(人造血干细胞植入能力的验证4)

接下来，针对剖检的各小鼠，调查了造血器官(骨髓·脾脏·血液)中的hcd45⁺细胞之中hcd3⁺t细胞、hcd19⁺b细胞、hcd33⁺髓细胞、hcd56⁺nk细胞所占的比例(hcd45中的比例，freq.ofhcd45(％))、及1μl血液中的各细胞的细胞数量(绝对细胞数量(×10³个细胞/μl))。实施双因素方差分析的结果示于图12。

(结果)

由图12可见，在上述人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠、人造血干细胞移植nog小鼠、及人造血干细胞移植nog-fcgrko/+小鼠中，都检测出hcd33⁺髓系细胞、hcd19⁺b细胞、hcd3⁺t细胞、hcd56⁺nk细胞的所有级分，但特别的是，在人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠中，针对脾脏的hcd19⁺b细胞(e)检测出显著多的细胞数量，其是nog小鼠的2.5倍以上、ko/+小鼠的1.2倍以上。

[实施例13]

(t细胞亚群的分化)

一般而言，已知hcd3⁺t细胞还分为cd4⁺t细胞·cd8⁺t细胞·cd4⁺cd8⁺双阳性(doublepositive：dp)t细胞的亚群。因此，针对上述移植了人造血干细胞的、nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠，对外周血采集试样，使用以下所示的荧光色素标记抗原特异抗体进行抗体染色后，利用流式细胞术测定荧光强度，由此对t细胞亚群的分化情况进行评价。结果示于图13。

需要说明的是，此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下。

pe标记抗hcd4抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd8a抗体(biolegend公司)

brilliantviolet421标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

brilliantviolet510标记抗hcd45抗体(biolegend公司)

brilliantviolet605标记人pd-1(cd279)抗体(biolegend公司)

(结果)

由图13可见，在移植了人造血干细胞的任一种nog-fcgrko/ko小鼠、nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠中，hcd4⁺t细胞·hcd8⁺t细胞·hcd4⁺hcd8⁺hdpt细胞的亚群均正常地分化，确认了血液免疫系统的重建(图13(a))。此外，观察在人t细胞中表达的programmedcelldeath1(pd-1)蛋白分子hpd-1的表达，结果确认了hcd4⁺级分中还表达hpd-1分子(图13(b))。

因此，确认了即使fcgr缺损也不会影响这些功能。

[实施例14]

(人血液免疫系统得到重建的nog-fcgrko/ko小鼠中的针对人免疫细胞的小鼠adcc活性的验证)

向7周龄以上的成体nog-fcgrko/ko小鼠照射x射线，由此抑制骨髓，在照射x射线后1天以内经由尾静脉移植50000个的人造血干细胞，由此制备了人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠。针对在人造血细胞移植后的第16周确认到hcd3⁺t细胞分化的小鼠，在人造血干细胞移植后的第18周、19周、及20周时，以每周1次、共计3次施予特异性识别在人t细胞中表达的pd-1蛋白分子的抗人pd-1抗体(opdivo)(bristol-myerssquibb公司制)各100μg，然后，剖检小鼠，利用流式细胞术对骨髓·脾脏·血液各造血组织中的、包括人t细胞在内的人免疫细胞的增减进行分析。针对人造血干细胞移植nog小鼠、及人造血干细胞移植nog-fcgrko/+小鼠也实施同样的处理，作为比较对象。结果示于图14。

需要说明的是，此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下。

pe标记抗hcd4抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd8a抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd19抗体(biolegend公司)

apc-r700标记抗hcd19抗体(bectondickinson公司)

apc-r700标记抗hcd56抗体(bectondickinson公司)

brilliantviolet421标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

brilliantviolet510标记hcd45抗体(biolegend公司)

brilliantviolet605标记人pd-1(cd279)抗体(biolegend公司)

buv395标记抗hcd33抗体(bectondickinson公司)

apc/cy7标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

(结果)

由图14(a)～(c)可见，关于施予了opdivo的各小鼠的骨髓·脾脏·血液中的hcd45⁺细胞的比例(hcd45⁺inmnc(％))，在任何器官中均未观察到显著性差异。另一方面，由图14(e)可见，在施予了opdivo的人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠中，脾脏中检测到的hcd45+细胞数量(绝对细胞数量(×106个细胞))为施予了opdivo的人造血干细胞移植nog小鼠中的4.2倍、施予了opdivo的人造血干细胞移植nog-fcgrko/+小鼠中的2.2倍以上，这表明在nog-fcgrko/ko小鼠中的植入未伴随hcd45+细胞数量减少。

[实施例15]

对上述施予了opdivo的各人造血干细胞移植小鼠进行分析，调查了hcd45⁺细胞的详细情况。结果示于图15。

(结果)

由图15可见，在任一种上述施予了opdivo的各小鼠中，均检测出hcd3⁺t细胞、hcd19⁺b细胞、hcd33⁺髓系细胞、hcd56⁺nk细胞的各级分。另外，opdivo施予人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠的脾脏(图15(b))及外周血(图15(c))中，植入未伴随hcd3⁺t细胞减少，其hcd3⁺t细胞的比例多达nog小鼠的2倍以上。另外，脾脏(图15(e))中，hcd3⁺t细胞数量为nog小鼠的3倍以上，hcd19⁺b细胞也为nog小鼠的3倍以上。

[实施例16]

针对上述检测出的脾脏的hcd45⁺细胞中的hcd3⁺t细胞，还对t细胞的亚群(subset)进行了验证。结果示于图16。

(结果)

由图16可见，opdivo施予人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠的脾脏中的hcd45⁺细胞中的hcd4⁺t细胞的比例显著高于施予了opdivo的人造血干细胞移植nog及施予了opdivo的人造血干细胞移植nog-fcgrko/+小鼠，为nog小鼠、nog-fcgrko/+小鼠的3倍以上。hcd4⁺t细胞数量也为nog小鼠、nog-fcgrko/+小鼠的8倍以上，hcd8⁺t细胞数量也为nog小鼠、nog-fcgrko/+小鼠的4倍以上，t细胞亚群细胞数量也显著地多。

(实施例14～实施例16的总结)

上述结果提示，nog小鼠及nog-fcgrko/+小鼠中，由于存在小鼠fcgr分子，因此可经由抗pd-1抗体将hpd-1⁺t细胞从小鼠生物体中除去，而nog-fcgrko/ko小鼠中fcgr分子缺损，因此不会发生依赖于抗pd-1抗体的人t细胞的除去。

[实施例17]

(来源于人外周血的单核细胞级分(peripheralbloodderivedmonoclonalcells：pbmc)植入能力的验证)

对nog-fcgrko/ko小鼠中的人pbmc的植入能力进行了验证。向7周龄以上的成体nog-fcgrko/ko小鼠经由小鼠尾静脉移植1500000个或2500000个的人pbmc，由此制备了人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠。针对nog小鼠也实施与上述同样的制备处理，由此制备人pbmc移植nog小鼠，作为比较对象。

(基于流式细胞术的验证)

针对上述各小鼠，在移植人pbmc后的第2周、4周、5周及/或6周时进行采血，通过与实施例2同样的方法得到白细胞级分。此外，将白细胞级分使用以下所示的荧光色素标记抗原特异抗体进行抗体染色后，利用流式细胞术测定荧光强度，由此测定人免疫细胞hcd45+细胞的比例。结果示于图17。

需要说明的是，此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下。

fitc标记抗hcd33抗体(biolegend公司)

pe标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd19抗体(biolegend公司)

apc标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

apc/cy7标记抗hcd45抗体(biolegend公司)

fitc标记抗hcd4抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd19抗体(biolegend公司)

apc标记抗hcd19抗体(biolegend公司)

apc-r700标记抗hcd56抗体(bectondickinson公司)

apc/cy7标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

brilliantviolet421标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

brilliantviolet510标记hcd45抗体(biolegend公司)

(结果)

由图17(a)及(b)可见，在任意移植了2500000个的人pbmc的nog-fcgrko/ko小鼠及人pbmc移植nog小鼠中，均确认到hcd45⁺细胞的植入，但就细胞植入率而言，人pbmc移植nog小鼠中于第4周为平均10％左右，与此相对，在人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠中，于第4周为平均48％，在第4周这样的早期即显示出较之nog小鼠而言为3.5倍以上的值。另外，在减少移植细胞数量、移植1500000个的人pbmc并于第2周实施评价的情况下，由图17(c)可见，就细胞植入率而言，人pbmc移植nog小鼠中小于0.5％，与此相对，人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠中为1～8％，是nog小鼠的2～16倍。另外，由图17(d)可见，就植入细胞数量而言，人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠为50-200/μl，与此相对，人pbmc移植nog小鼠中为10/μl左右，由此确认，人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠中的植入细胞数显著高于人pbmc移植nog小鼠，尤其是在pbmc移植后的早期，以及即使pbmc的移植数量少于通常实施的情况下。

[实施例18]

(人pbmc植入能力)

针对上述人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠及人pbmc移植nog小鼠，在人pbmc移植后的第4周时，调查了外周血中的hcd45⁺细胞的详细情况。结果示于图18。

需要说明的是，此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下。

fitc标记抗hcd4抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

apc/cy7标记抗hcd45抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd19抗体(biolegend公司)

apc标记抗hcd8a抗体(biolegend公司)

apc-r700标记抗hcd56抗体(bectondickinson公司)

apc/cy7标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

brilliantviolet421标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

brilliantviolet510标记hcd45抗体(biolegend公司)

(结果)

由图18(a)及(c)可见，确认了上述人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠中，hcd3⁺t细胞占hcd45⁺细胞的97％以上。移植了1500000个的人pbmc的nog小鼠中，hcd3⁺t细胞的比例为75％左右。由图18(b)及(d)可见，针对t细胞亚群，上述任何的人pbmc移植小鼠中均检测出cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、cd4⁺cd8⁺dpt细胞中的任何级分。

[实施例19]

(人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠中的针对人免疫细胞的抗体反应性)

通过基于hcd3⁺t细胞的流式细胞术的分析，显示出在人pbmc移植nog小鼠及人pbmc移植nog-fcgrko/+小鼠中增殖的来源于人pbmc的hcd3+细胞大部分表达pd-1分子，pd-1分子在人pbmc移植nog-fcgrko/ko小鼠中也同样地表达(图19(a))。此外，通过在pbmc移植后第5周、第6周、第7周向上述各小鼠各施予抗人pd-1抗体(小鼠igg1型(克隆j116))50μg，对是否诱导针对人pd-1⁺t细胞的细胞毒性进行了验证。结果示于图19(b)。

(结果)

由图19(b)可见，nog-fcgrko/ko小鼠中，即使施予抗人pd-1抗体(小鼠igg1型)，也未引起hcd45⁺细胞中的人t细胞的比例的减少。另一方面，人pbmc移植nog小鼠及人pbmc移植nog-fcgrko/+小鼠中，hcd45⁺细胞中的人t细胞的比例非常低。因此，确认了nog-fcgrko/ko小鼠中，由于fcgr分子缺损，因此不会发生依赖于抗人pd-1抗体的人t细胞的除去。

[实施例20]

(杂交型动物模型的建立)

尝试了通过使能够在小鼠生物体内扩增·维持人nk细胞的nog-hil-15tg小鼠与nog-fcgrko/ko小鼠配种来制作具有两者的特性的动物模型。即，将nog-fcgrko/ko小鼠与nog-hil-15tg小鼠进行交配，制作了nog-fcgrko/ko，hil-15tg小鼠。

[实施例21]

(体外培养并经过扩增的来源于人外周血的nk细胞(扩增的(expanded)nk细胞)的植入能力的验证)

对nog-fcgrko/ko，hil-15tg小鼠中的人扩增的nk细胞的植入能力进行了验证。向7周龄以上的成体nog-fcgrko/ko，hil-15tg小鼠经由小鼠尾静脉移植3850000个的人扩增的nk细胞，由此制备了人扩增的nk细胞移植nog-fcgrko/ko，hil-15tg小鼠(fcgrko/ko，hil-15tg)。针对nog-hil-15tg小鼠也实施与上述同样的制备处理，由此制备人扩增的nk细胞移植nog-hil-15tg小鼠(fcgr+/+，hil-15tg)，作为比较对象。

针对上述人扩增的nk细胞移植nog-fcgrko/ko，hil-15tg小鼠及人扩增的nk细胞移植nog-hil-15tg小鼠，在人扩增的nk细胞移植后的第2周时采集外周血，调查了hcd45⁺细胞的植入性。结果示于图20。

需要说明的是，此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下。

apc-r700标记抗hcd56抗体(bectondickinson公司)

apc/cy7标记抗小鼠cd45抗体(biolegend公司)

brilliantviolet421标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

brilliantviolet510标记抗hcd45抗体(biolegend公司)

(结果)

由图20(a)可见，上述任何的人扩增的nk细胞移植小鼠中均确认到hcd45⁺细胞的植入。另外，由图20(b)可见，确认hcd56⁺nk细胞占hcd45⁺细胞的80％以上。上述结果表明，nog-fcgrko/kohil-15tg小鼠保有nog-hil-15tg小鼠的人nk细胞植入性的特性，即，保有在移植来源于人外周血的人nk细胞后、能够在体内长期检测出hcd56⁺细胞。

向上述nog-fcgrko/ko，hil-15tg小鼠经由尾静脉移植1500000个daudi。在移植3天后，经由尾静脉移植8500000个的体外培养并经过扩增的来源于人外周血的nk细胞(扩增的nk细胞)，进而以每周1次向腹腔内施予人抗体药物抗cd20抗体利妥昔单抗25μg。在3周后，测定肾脏的重量，实施评价。在另行将nog-hil-15tg小鼠交配而制作nog-fcgrko/+，hil-15tg小鼠的基础上，经由尾静脉移植1500000个daudi，另外，向nog-fcgrko/+小鼠也经由尾静脉移植1500000个daudi，将它们均作为比较对象。结果示于图21。

由图21可见，nog-fcgrko/+(-non-tg)小鼠中，肾脏的重量由于施予利妥昔单抗而得到抑制。相反地，nog-fcgrko/ko，non-tg小鼠中，即使是利妥昔单抗施予组也观察到肾脏重量的增加。此外，nog-fcgrko/kohil-15tg小鼠中，仅移植nk细胞或单独施予利妥昔单抗的的情况下，肾脏重量保持增加的状态，但通过施予两者，肾脏的肥大化得到了抑制。上述结果表明，nog-fcgrko/kohil-15tg小鼠具有nog-fcgrko/ko小鼠和nog-hil-15tg小鼠各自的特性，不受小鼠吞噬细胞影响，仅将人nk细胞作为效应细胞，能够评价针对与癌抗原特异性的人抗体结合的肿瘤的adcc活性。

[实施例22]

以下，在基因改造免疫缺陷小鼠中使人免疫细胞和人肿瘤细胞共存，然后对是否能够评价抗人抗体的生理活性进行了研究。即，使用人细胞植入免疫缺陷小鼠，对作为免疫检测点抑制剂发挥作用的抗人细胞表面蛋白分子抗体的活性、作用机制进行了评价。

(免疫检测点抑制剂的肿瘤抑制反应的亢进功能的验证)

对人血液免疫系统得以重建的nog-fcgrko/ko小鼠中的、人免疫检测点抑制剂的功能进行了评价。作为免疫检测点抑制剂，使用了抗人pd-1抗体、纳武单抗(nivolumab)(bristol-myerssquibb公司制)。通过向8周龄以上的成体nog-fcgrko/ko小鼠照射x射线，由此抑制骨髓，在照射x射线后1天以内经由尾静脉移植50000个的人造血干细胞，由此制备了人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠。针对人造血干细胞移植后经过16周以上、确认到人cd3⁺t细胞的分化的人造血干细胞移植nog-fcgrko/ko小鼠，在人造血干细胞移植后的第24周时皮下移植人头颈部扁平上皮癌细胞株hsc-4(1500000个)，由此制备了hsc-4移植nog-fcgrko/ko小鼠(图22中的day0)。

对于上述小鼠，在移植hsc-4后每1周向腹腔内施予200μg的纳武单抗。在移植hsc-4后的第7天、14天、21天、28天时，测量肿瘤大小。针对nog小鼠也通过与上述同样的步骤，制备人造血干细胞移植nog小鼠，然后制备hsc-4移植nog(-fcgr+/+)小鼠。另外，将代替抗体施予pbs的上述2种小鼠作为pbs施予对照组。肿瘤大小的测定结果示于图22。

(结果)

由图22(b)可见，hsc-4移植nog-fcgrko/ko小鼠中，施予pbs的情况下，第28天的肿瘤大小为平均1300mm³。另一方面，施予纳武单抗的情况下，第28天的肿瘤大小为平均600mm³，较之pbs施予组而言，确认到由纳武单抗抗体施予所带来的肿瘤抑制效果。另一方面，由图22(a)可见，hsc-4移植nog-fcgr+/+小鼠中，第28天的肿瘤大小无论在施予pbs的情况下还是施予纳武单抗的情况下均为平均1000mm³，未确认到由纳武单抗抗体施予所带来的肿瘤抑制效果。该结果显示，在hsc-4移植nog-fcgrko/ko小鼠中检测出利用免疫检测点抑制剂使肿瘤抑制反应亢进的功能，但在hsc-4移植nog(-fcgr+/+)小鼠中，未检测出使肿瘤抑制反应亢进的功能，确认了在上述使人免疫细胞和人肿瘤细胞共存的hsc-4移植nog-fcgrko/ko小鼠中，能够对使肿瘤抑制反应亢进的功能等生理活性进行评价。

[实施例23]

(人免疫检测点抑制剂的t细胞浸润的亢进功能的验证)

针对上述hsc-4移植nog-fcgrko/ko小鼠，在人造血干细胞移植后的第28周时进行采血，在人造血细胞移植后的第28周时(实施抗人pd-1抗体(纳武单抗)的最终施予的翌日)剖检小鼠，采集脾脏和肿瘤。利用流式细胞术对肿瘤·脾脏·血液各组织中的、包括人t细胞在内的人免疫细胞的增减进行分析。进而，关于血液和脾脏，通过与实施例2同样的方法得到白细胞级分。针对hsc-4移植nog(-fcgr+/+)小鼠也实施同样的处理，作为比较对象。

需要说明的是，将上述肿瘤在含有1mg/ml的iv型胶原酶(collagenase)iv(sigma公司制)/100μg/ml的dnasei(sigma公司制)的rpmi1640(invitrogen公司制)培养基中细细切割，然后一边使用gentlemacsdissociater(miltenyibiotec公司制)悬浮，一边于37℃反应合计60分钟，由此分离细胞，从细胞悬浮级分中得到白细胞级分。此外，将白细胞级分使用以下所示的荧光色素标记抗原特异抗体进行抗体染色后，利用流式细胞术测定荧光强度，由此测定人免疫细胞hcd45+cd3+细胞的比例。结果示于图23。

需要说明的是，此处使用的荧光色素标记抗原特异抗体如下。

fitc标记抗hcd44抗体(biolegend公司)

pe标记抗hpd-1抗体(biolegend公司)

pe/cy7标记抗hcd8a抗体(biolegend公司)

percp-cy5.5标记抗mcd45抗体(biolegend公司)

apc标记抗hcd69抗体(biolegend公司)

alexafluor-r700标记抗hcd19抗体(bectondickinson公司)

apc-cy7标记抗hcd4抗体(biolegend公司)

brilliantviolet421标记抗hcd3抗体(biolegend公司)

brilliantviolet510标记hcd45抗体(biolegend公司)

brilliantviolet605标记人pd-1(cd279)抗体(biolegend公司)

(结果1)

由图23(a)可见，hsc-4皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠中，施予pbs的情况下，浸润至肿瘤内的单核细胞级分中人t细胞所占比例为平均12％，而在施予纳武单抗的情况下，人t细胞所占比例为30％，较pbs施予组而言，确认到由纳武单抗抗体施予所带来的人t细胞向肿瘤内的浸润的亢进。另一方面，hsc-4皮下移植nog-fcgr+/+小鼠中，施予pbs的情况下，浸润至肿瘤内的单核细胞级分中人t细胞所占比例为平均2.3％，而施予纳武单抗的情况下，人t细胞所占比例为0.7％，较pbs施予组而言，确认到由纳武单抗抗体施予所带来的进入肿瘤的人t细胞减少。另外，由图23(b)及(c)可见，hsc-4皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠的脾脏及血液中，施予纳武单抗的情况下，人t细胞所占比例在脾脏中为平均31.5％，外周血中为平均20.8％，而施予pbs的情况下，脾脏为平均9.8％，外周血为平均11.6％，较之pbs施予组而言更多，确认了通过施予纳武单抗抗体，人t细胞的比例增加。hsc-4皮下移植nog-fcgr+/+小鼠中，施予纳武单抗的情况下，人t细胞所占比例在脾脏中为平均6.0％，外周血中为平均1.8％，而施予pbs的情况下，脾脏中为平均9.2％，外周血中为平均2.8％，确认了由纳武单抗抗体施予所带来的人t细胞数量的减少。

(结果2)

由图23(d)可见，hsc-4皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠中，施予pbs的情况下，肿瘤内的人t细胞数量为平均600000个，而另一方面，施予纳武单抗的情况下，肿瘤内的人t细胞数量为平均2100000个，并且，较之pbs施予组而言，确认到由纳武单抗抗体施予带来的肿瘤内的人t细胞数量增加。但是，hsc-4皮下移植nog-fcgr+/+小鼠中，施予pbs的情况下，肿瘤内的人t细胞数量为平均140000个，而施予纳武单抗的情况下，肿瘤内的人t细胞数量为平均36000个，并且，较之pbs施予组而言，确认到由纳武单抗抗体施予所带来的进入肿瘤内的人t细胞数量减少。另外，由图23(e)及(f)可见，hsc-4皮下移植nog-fcgrko/ko小鼠的脾脏及血液中，施予纳武单抗的情况下，人t细胞数量在脾脏中为平均12400000个，外周血中为平均1270000个/ml，而施予pbs的情况下，脾脏中为平均2600000个，外周血中为平均350000个/ml，较之pbs施予组而言更多，确认了通过施予纳武单抗抗体，人t细胞数量增加。hsc-4皮下移植nog-fcgr+/+小鼠中，施予纳武单抗的情况下，人t细胞数量在脾脏中为平均800000个，外周血中为平均60000个/ml，而施予pbs的情况下，脾脏中为平均2000000个，外周血中为平均190000个/ml，确认到由纳武单抗抗体施予所带来的人t细胞数量减少。

以上的结果表明，nog(-fcgr+/+)小鼠中，肿瘤内的pd-1+t细胞经由抗pd-1抗体而被小鼠吞噬细胞损伤，但nog-fcgrko/ko小鼠中，能够检测出免疫检测点抑制剂的生理活性，即t细胞向肿瘤内的浸润的亢进效果。

产业上的可利用性

本发明的小鼠作为不受小鼠吞噬细胞的影响、能够评价adcc活性的人源化免疫缺陷小鼠，在医学领域中非常有用。