一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法。

背景技术：

通过植物组织培养技术研究植物基因功能的有效途径。目前该技术在植物再生工作中得到广泛的应用，但对于如何缩短植物再生的时间研究还不深入，尤其是如何快速诱导良好的愈伤组织形成。

二穗短柄草作为世界上分布最广泛的c3植物，因其基因组小、生长周期短、体量小、适合遗传转化、实验室和田间操作等优势而被定义为新的模式植物。同时二穗短柄草和小麦同属早熟禾亚科，而该亚科植物种子具有明显的休眠现象，种子需要经历一定时间的休眠期以完成生理后熟过程。

二穗短柄草种子属于胚依赖型生理性休眠，快速诱导愈伤组织的关键是打破其胚依赖性。这一过程需要外界的物理刺激，并需要化学诱导剂的协同作用，促进愈伤组织形成。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法，能够快速打破二穗短柄草种子休眠的特性，缩短愈伤组织诱导时间，并用于植物再生和遗传转化研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，包括ms基本培养基、fpx、cuso4。

所述fpx的浓度为45-100μm。

所述cuso4的浓度为0.6mg/l。

所述45-100umfpx的配制方法为：388.84mg溶于5mldmso溶液，搅拌溶解后，用蒸馏水补至10ml，得到100mmfpx母液，取450ul-1ml的100mmfpx母液加到1l培养基中得到45-100um的fpx。

所述0.6mg/mlcuso4的配制方法为：将50mgcuso4·5h2o溶解到50ml的蒸馏水中，得到1mg/mlcuso4，4℃黑暗保存，取600ul1mg/mlcuso4到1l的培养基中配制成终浓度为0.6mg/l的cuso4。

6.25％次氯酸钠溶液的配制方法：吸取12.5ml次氯酸钠溶于180ml蒸馏水中，用蒸馏水补至200ml。

1mkoh的配制方法：5.6gkoh固体溶于100ml去离子水中，得到1mkoh溶液。

所述培养基的配制方法：4.43gms粉末和30g蔗糖溶于1l去离子水，添加3gphytagel，搅拌均匀，用1mkoh调整ph为5.8；121℃高压灭菌15min；灭菌完成后，取出培养基，待培养基冷却后，添加45-100umfpx，摇匀后，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，培养基凝固后，封口膜包裹培养皿，4℃黑暗保存。

一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的方法，包括如下步骤：

(1)超净工作台中，用镊子去除二穗短柄草种子上的外稃，置于50ml离心管中，用20ml75％乙醇将种子表面灭菌30s，无菌去离子水冲洗三次，再加入20ml的6.25％次氯酸钠溶液，上下颠倒混匀，消毒15分钟，用无菌去离子水冲洗3-6次，得到灭菌后的种子；

(2)将灭菌后的种子用外科手术刀切割，切除部分胚乳，保留切割后含胚的部分，将切割后的种子置于无菌滤纸上吸去表面水分；

(3)将吸干表面水分的种子放置到培养基上，胚朝上，培养皿置于黑暗条件下培养，培养三天后即出现愈伤组织。

步骤(3)中，所述培养条件为温度26-30℃，湿度50％-70％。

本发明具有有益效果：本发明利用外科手术刀切割二穗短柄草种子，打破谷类作物种子休眠，并通过fipexide新型化学诱导剂，快速诱导谷类作物种子愈伤组织的形成，至少提前7天诱导二穗短柄草种子形成愈伤组织；本发明为打破种子休眠促进愈伤组织形成的研究积累了宝贵材料，有利于种子休眠机制和二穗短柄草转基因育种工作的研究。

附图说明

图1为二穗短柄草种子的切割示意图；其中a为切割处理操作图，b为切割后示意图；

图2为切割种子和未切割种子的愈伤组织诱导结果图；其中对照组采用未切割种子、ms培养基；处理组采用切割后的种子、ms基本培养基+fpx+cuso4。

具体实施方式

本发明所用试剂耗材：

75％酒精(国药集团化学试剂有限公司，货号8017696)

次氯酸钠(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号a501944)

滤纸(杭州特种纸业有限公司，中速9cm)

外科手术刀片(上海医疗器械有限公司手术器械厂，货号j0b080)

ms培养基(phytotechnology，货号m519)

fipexide(mec,货号hy-b1124)

cuso4·5h2o(国药集团化学试剂有限公司，货号10008216)

植物凝胶phytagel(sigma,p8169)

蔗糖(北京索莱宝科技有限公司，货号s8270)

氢氧化钾koh(国药集团化学试剂有限公司，货号10017008)

盐酸hcl(国药集团化学试剂有限公司，货号10011018)

ph酸度测定仪(安莱立思仪器科技(上海)有限公司，货号ph400)

biofil培养皿(广州洁特生物过滤股份有限公司，货号tcd000090)

下面将结合本发明中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：

一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，包括ms基本培养基+100umfpx+0.6mg/lcuso4。fipexide(fpx)是一种新型的化学诱导剂。

所述100umfpx的配制方法为：388.84mg溶于5mldmso溶液，搅拌溶解后，用蒸馏水补至10ml，得到100mmfpx母液，取1ml的100mmfpx母液加到1l培养基中得到45-100um的fpx。

所述0.6mg/mlcuso4的配制方法为：将50mgcuso4·5h2o溶解到50ml的蒸馏水中，得到1mg/mlcuso4，4℃黑暗保存，取600ul1mg/mlcuso4到1l的培养基中配制成终浓度为0.6mg/l的cuso4。

6.25％次氯酸钠溶液的配制方法：吸取12.5ml次氯酸钠溶于180ml蒸馏水中，用蒸馏水补至200ml。

1mkoh的配制方法：5.6gkoh固体溶于100ml去离子水中，得到1mkoh溶液。

所述培养基的配制方法：4.43gms粉末和30g蔗糖溶于1l去离子水，添加3gphytagel，搅拌均匀，用1mkoh调整ph为5.8；121℃高压灭菌15min；灭菌完成后，取出培养基，待培养基冷却后，添加45-100umfpx，摇匀后，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，培养基凝固后，封口膜包裹培养皿，4℃黑暗保存。

一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的方法，包括如下步骤：

(1)超净工作台中，用镊子去除二穗短柄草种子上的外稃，置于50ml离心管中，用20ml75％乙醇将种子表面灭菌30s，无菌去离子水冲洗三次，再加入20ml的6.25％次氯酸钠溶液，上下颠倒混匀，消毒15分钟，用无菌去离子水冲洗3-6次，得到灭菌后的种子；

(2)如图1所示，将灭菌后的种子用外科手术刀切割，切除部分胚乳，保留切割后含胚的部分，将切割后的种子置于无菌滤纸上吸去表面水分；

(3)将吸干表面水分的种子放置到培养基上，胚朝上，培养皿置于黑暗条件下培养，培养三天后即出现愈伤组织。

步骤(3)中，所述培养条件为温度26-30℃，湿度50％-70％。

从图2中可以看到，本发明切割过的短柄草种子在转到愈伤诱导培养基三天后就开始出现小的愈伤组织，而对照组中未切割的种子要到15天时才会出现少量的愈伤组织，表明本发明可以促进短柄草愈伤组织的形成。

由于短柄草属于早熟禾亚科，与小麦近缘，其种子具有明显的休眠特性，不仅会影响作物的产量和品质，也会影响种子作为外植体的生理状态，进而影响愈伤组织的诱导。本发明利用外科手术刀对短柄草种子进行切割处理，在含有fpx的愈伤组织诱导培养基上可显著促进愈伤组织形成，证明了该方法是有效的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。