本发明涉及微生物制剂技术领域，尤其是一种防治烟草花叶病毒的微生物制剂及其制备方法。
背景技术：
烟草花叶病毒(tmv)是一种单链rna病毒，对植物具有极强的侵染性和致病力。烟草花叶病毒病广泛分布于我国各烟区，是烟草主要病毒病害。
过去，烟草花叶病毒病的防治主要采用化学农药和转基因育种方法。但化学农药导致病毒的抗药性日益明显且造成了高量的农药残留；同样，虽然转基因技术可以高效的控制病毒病的发生和发展，但其生物安全性却引起了国内外专家和政府的高度重视。
因此，技术人员研究微生物防治方法，其原理简单来说就是，将微生物菌剂喷洒至植株叶片上，微生物有益菌附着于烟草叶片上，经过正常生命活动释放出有益于植株的，能够提高植株抗病免疫能力的生物化学物质，并被植物吸收利用，取得了一定的防治效果。
但微生物菌群的有益活动提高的是植株的生物整体的抗病免疫能力，而非专门针对于烟草花叶病毒的抵抗力，因此当植株感染烟草花叶病毒后，需要一个较长的时间进行免疫反应，即使后续成功限制了病毒的感染情况，植株本身也受到了一定程度的损伤，导致烟叶质量降低。
同时，微生物菌群为了适应生长环境，以及扩大菌群数量，需要较长的时间，且降雨或向叶片喷洒药液也会对微生物菌群在叶片的附着造成一定程度的影响，因此为了保证微生物防治的效果，需要进行多次喷药，种植工作强度较大。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提出了一种靶向针对性强，抗病免疫效果好，且防治效果持续时间久的防治烟草花叶病毒的微生物制剂及其制备方法。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种防治烟草花叶病毒的微生物制剂，包括微生物混合菌剂、植物免疫诱抗剂和叶片提取液，叶片提取液为喷淋植物免疫诱抗剂后产生免疫反应的烟草植株的叶片提取液，微生物混合菌剂、植物免疫诱抗剂和叶片提取液的质量百分比为微生物混合菌剂5％～10％、植物免疫诱抗剂3％～5％和叶片提取液10％～15％，余量为无菌水。
在以上技术方案的基础上，优选的，微生物混合菌剂包括解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌，解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌的质量比为(2～3)：(2～3)。
在以上技术方案的基础上，优选的，植物免疫诱抗剂为烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液。
更进一步优选的，还包括表面活性剂，表面活性剂为吐温80、有机硅、乙氧基改性聚三硅氧烷或丁二酸二脂磺酸钠。
更进一步优选的，表面活性剂的质量占溶液质量的1％～3％。
更进一步优选的，吐温80的质量百分比为3％，或有机硅的质量百分比为2％，或乙氧基改性聚三硅氧烷的质量百分比为1％，或丁二酸二脂磺酸钠的质量百分比为1.5％。
第二方面，提供了一种防治烟草花叶病毒的微生物制剂的制备方法，包括以下步骤，
s1制备微生物混合菌剂各菌种的种子液，将种子液分别进行发酵扩繁，将扩繁产物按照配比均匀混合；
s2在烟草花叶病毒溶液中加入乙酸，混匀后静置，离心去除rna沉淀，然后将上清液经过脱盐柱分离，去除乙酸，将所得到的溶液在去离子水中透析12至24h，离心，将所得到的沉淀用磷酸缓冲溶液复溶，得到烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液；
s3使用步骤s2中获得的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液喷淋烟草植株的叶片，待烟草植株产生免疫反应后，摘取植株叶片，粉碎后采用水提取法获得提取混合液，然后滤除固体杂质得到叶片提取液；
s4将步骤s1至s3中的获得产物按照配比均匀混合，得到混合溶剂；
s5向步骤s4中的混合溶剂内按照配比加入表面活性剂，搅拌1至2h即可。
在以上技术方案的基础上，优选的，在步骤s3中，待向烟草植株的叶片喷淋烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液1至2h后，提取叶片提取液，然后通过离子分离色谱和高效液相色谱的方法，从叶片提取液中分离出单一组分，并利用质谱鉴定的方法得到该单一组分的组成，以鉴定烟草植株是否产生免疫反应产物。
本发明的一种防治烟草花叶病毒的微生物制剂及其制备方法相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明中的植物免疫诱抗剂起到了免疫激发因子的作用，当接触烟草植株叶片后，液剂内的衣壳蛋白会引发植物免疫系统产生应激性免疫反应，诱导其产生针对于烟草花叶病毒的免疫抗性，同时叶片提取液内含有大量的能够限制病毒增殖的生物化学物质，在植株自身的免疫反应还未完全发挥效力时，叶片提取液内的生物化学物质起到一定的病毒防治作用，有效提高了植物的针对性免疫能力，且安全可靠，也避免了药物残留及抗药性的风险。
(2)本发明中的微生物混合菌剂作为有益菌群，能够有效的提高植物的基础免疫能力，且微生物菌群还能产生多种物质，促进植物对营养物质的吸收和利用，并在随降水进入泥土后，大幅改善土壤结构，增加土壤肥力，进而提高烟草叶片的种植质量。
(3)本发明中的表面活性剂能够加强微生物菌群在烟草叶片上的分散附着能力，降低降水对菌群附着的不良影响，延长菌群在叶片上发挥效力的时间，进而提高微生物防治的效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明提供了一种防治烟草花叶病毒的微生物制剂，包括微生物混合菌剂、烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液和叶片提取液，叶片提取液为喷淋植物免疫诱抗剂后产生免疫反应的烟草植株的叶片提取液，微生物混合菌剂、植物免疫诱抗剂和叶片提取液的质量百分比为微生物混合菌剂10％、植物免疫诱抗剂5％和叶片提取液15％，余量为无菌水。
其中，微生物混合菌剂包括解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌，解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌的质量比为1：1。
其制备方法，包括以下步骤，
s1制备微生物混合菌剂各菌种的种子液，将种子液分别进行发酵扩繁，将扩繁产物按照配比均匀混合；
s2在烟草花叶病毒溶液中加入乙酸，混匀后静置，离心去除rna沉淀，然后将上清液经过脱盐柱分离，去除乙酸，将所得到的溶液在去离子水中透析12至24h，离心，将所得到的沉淀用磷酸缓冲溶液复溶，得到烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液；
s3使用步骤s2中获得的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液喷淋烟草植株的叶片，待烟草植株产生免疫反应后，摘取植株叶片，粉碎后采用水提取法获得提取混合液，然后滤除固体杂质得到叶片提取液；
s4将步骤s1至s3中的获得产物按照配比均匀混合，得到混合溶剂；
s5向步骤s4中的混合溶剂内按照配比加入表面活性剂，搅拌1至2h即可。
其中，在步骤s3中，待向烟草植株的叶片喷淋烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液1至2h后，提取叶片提取液，然后通过离子分离色谱和高效液相色谱的方法，从叶片提取液中分离出单一组分，并利用质谱鉴定的方法得到该单一组分的组成，以鉴定烟草植株是否产生免疫反应产物。
实施例二：
将实施例一中的微生物混合菌剂、植物免疫诱抗剂和叶片提取液的质量百分比为微生物混合菌剂5％、植物免疫诱抗剂3％和叶片提取液10％，其他条件保持不变。
实施例三：
除实施例一条件保持不变外，还包括表面活性剂。
其中，表面活性剂为吐温80，吐温80的质量占溶液质量的3％。
解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌是自然界广泛存在的益生菌种，均属于革兰氏阳性菌，广泛应用于食品发酵、工业生产、种植养殖和医疗保健等领域，或作为生防菌被广泛使用。二者作为微生物制剂被喷洒至植物或土壤后，会向环境中释放大量有益于植物生长的生物化学物质和营养物质，并能大幅改善土壤结构，进而促进植物的生长，提高植物的抗病免疫能力。
相比高等动物和人类的免疫系统的反应机理，植物免疫系统的反应机理较为特殊。植物和动物的区别就是植物没有完善的循环系统，所以无法像动物那样直接在血液中产生免疫细胞，并通过循环系统将免疫细胞输送至致病部位进行免疫反应。因此植物免疫系统的各种机制都是独立响应感染的，且每种机制都要有正确数量的特别蛋白，称为免疫受体，在正确位置去作相应的反应，或正确的结合使植物有效和高效作免疫反应，促使被侵染部位的植物细胞死亡，以组织病原扩散，而其他健康部位的组织受到激素信号调节，提前产生抗性以应对病原的来袭。同时，植物免疫系统内也有和动物免疫系统类似的系统性过敏反应，即拥有一定的“记忆功能”。
其中，植物免疫系统的免疫反应分为两种，分别为pti和eti。
当病原的侵染初期，病原会分泌一些毒性因子攻击植物细胞；植物为了逃避病原的攻击，逐步进化出细胞膜表面模式识别受体，用于识别病原遗传保守的病原相关分子模式并激发植物的基础免疫反应，即pti。这是一种普遍存在但强度较弱的抗性，可以抵抗多种病原的侵染。
当病原的侵染加重时，病原会进化出效应分子进入植物细胞，抑制植物产生的pti，克服植物的抗病性；植物针对病原效应分子会进化出相应的抗病蛋白，产生新的免疫反应，即eti；而病原会通过效应分子的变异来逃避识别，或分泌新的效应分子干扰eti。植物的免疫系统和病原均是在这种不断的斗争中协同进化，直至一方胜利得以使病原消灭或植物致病为止。
相比于pti，植物eti抗病性强度较强，但只针对于单一的病原，且植物免疫系统中用于免疫反应的营养物质有限，因此当病原侵染初期，pti发挥效力延迟或减轻病害的发生和发展，而eti则需要一定的反应时间才能完全发挥效力。
因此，本发明采用烟草花叶病毒衣壳蛋白作为植物免疫诱抗剂，诱导植物免疫系统对该衣壳蛋白产生系统性过敏反应，产生“免疫记忆”，有助于植物受到病毒侵染时，靶向性的激发eti；同时叶片提取液提取自发生了免疫反应的烟草植株，因此溶液内含有大量的能够限制病毒增殖的生物化学物质，在植株自身的免疫反应还未完全发挥效力时，能够起到一定的病毒防治作用。而烟草花叶病毒衣壳蛋白内并没有烟草花叶病毒的遗传物质，因此不会侵染植物造成致病，安全可靠，也避免了抗药性增强或药物残留的问题。
吐温80、有机硅、乙氧基改性聚三硅氧烷或丁二酸二脂磺酸钠为常见的表面活性剂，添加入液剂内，能够增大液剂的分散系数和提高液剂的附着能力，避免液剂在叶片上汇集形成液滴，进而提高了含有微生物菌剂的液剂的叶面附着效果。
试验方法以及结果分析：
将实施例1至3的制剂用水稀释至1000倍并搅拌均匀待用，并制备烟草花叶病毒悬浮液待用。试验均在绿色防虫温室内进行，以降低其他客观因素造成的误差。
需要说明的是，感染了烟草花叶病毒病的烟草叶片的鉴定方法按照《gb/t23222-2008(烟草病虫害分级及调查方法)》进行取样鉴定。
1、钝化实验
以烟草苗株为枯斑寄主，分别取实施例1至3的制剂180ul与烟草花叶病毒悬浮液20ul均匀混合，并在室温下静止处理1h，期间间歇性震荡。另外，以无菌水处理为空白对照，以相同浓度的微生物混合菌剂处理为对比实施例。
1h后使用移液器准确取上述各试验组液剂20ul，接种于位置、大小均一致的烟草苗株的整片叶子上，并用药用棉签涂抹均匀。
再将上述各苗株在室温及湿度70至80％条件下培养3至4天后，记录形成枯斑的数量。每个样品6个重复。抑制率根据如下公式计算：
抑制率＝[(c-t)/c]×100％
其中，c表示空白对照形成的枯斑数量；t表示处理后形成的枯斑数量。
2、预防试验
以烟草苗株为枯斑寄主，配制实施例1至3的制剂，同时以无菌水为空白对照，以相同浓度的微生物混合菌剂为对比实施例。
取上述各试验组液剂，用药用脱脂棉蘸取后均匀涂抹于位置、大小均一致的烟草苗株的整片叶子上，以药液不下滴为宜。
处理3h后，取病毒悬浮液20ul接种于上述个试验组处理后的叶片上，并用药用棉签涂抹均匀。
再将上述各苗株在室温及湿度70至80％条件下培养3至4天后，记录形成枯斑的数量。每个样品6个重复。抑制率根据如下公式计算：
抑制率＝[(c-t)/c]×100％
其中，c表示空白对照形成的枯斑数量；t表示处理后形成的枯斑数量。
3、治疗实验
以烟草苗株为枯斑寄主，配制实施例1至3的制剂，同时以无菌水为空白对照，以相同浓度的微生物混合菌剂为对比实施例。
用移液器取烟草花叶病毒悬浮液20ul，接种于位置、大小均一致的烟草苗株的整片叶子上，并用药用棉签涂抹均匀。
接种3h后，使用药用脱脂棉蘸取上述各试验组液剂，并均匀涂抹于预先接种了病毒的叶片上，以药液不下滴为宜。
再将上述各苗株在室温及湿度70至80％条件下培养3至4天后，记录形成枯斑的数量。每个样品6个重复。抑制率根据如下公式计算：
抑制率＝[(c-t)/c]×100％
其中，c表示空白对照形成的枯斑数量；t表示处理后形成的枯斑数量。
上述试验结果均见表1。
表1
通过试验可知，相比于单一的微生物菌剂，本发明的混合制剂在对烟草花叶病的钝化、防治和治疗上取得了较好的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。