具有增加的叶甜素含量的干燥植物材料的制备的制作方法

本发明涉及用于增加的叶甜素产量的绣球花(hydrangea)物种的培养(优选室内)以及具有增加的叶甜素含量的植物材料、优选干燥植物材料的提供。

背景技术：

1、消费者通常对具有大量高热量糖，特别是蔗糖(sucrose/saccharose)、葡萄糖、果糖或它们的混合物的食品或放纵食物有强烈偏好，这归因于与之相关的令人愉快的甜味和甜味特征。另一方面，众所周知，大量易于代谢的碳水化合物会造成血糖含量急剧上升，导致脂肪沉积物形成，并最终可能会导致健康问题，诸如超重、肥胖、胰岛素抵抗、年龄发病型糖尿病和它们的并发症。另一个特别的加重因素是许多上述碳水化合物也可能对牙齿健康具有不利影响，因为它们例如被口腔中特定类型的细菌分解成乳酸，并且可能会损害乳牙或恒牙的釉质(龋齿)。

2、因此，长期以来的目标是降低食物或饮料产品的高热量糖含量，并部分或全部用赋予甜味或可以在低浓度下对甜味产生正面影响而在此等低浓度下不会展现甜味本身的其它物质(味道调节剂)替代该高热量糖。

3、ep 2,298,084-b1中描述了叶甜素作为甜味剂减少型产品的味道调节剂的用途、用于该等产品的调味混合物以及生产该等产品的方法。

4、叶甜素为仅存在于植物大花绣球(hydrangea macrophylla)的亚种中的天然化合物。叶甜素不能通过化学合成或生物技术方法经济地生产出来。

5、大花绣球的叶主要用于制茶，特别是amacha，一种甜味日本茶，它含有单宁和二氢异香豆素，包括叶甜素。大花绣球的叶通常在日本和韩国用于仪式目的(浴佛节)。

6、东南亚和欧洲的大花绣球源头之间的气候条件显著不同。然而，一些大花绣球杂交种在欧洲被培育，以培养为园林植物。此等杂交种仅用作观赏植物，并且其中大多数不展现任何叶甜素存在。日本和韩国以外的大花绣球亚种amacha的商业化培养至今不为人知。

7、二氢异香豆素和叶甜素在叶中的分布强烈依赖于基因型，并且受环境条件影响不太明显。发现通过自由授粉繁殖的野生植物具有叶甜素含量，该叶甜素含量因植物而异(ujihara,m.等人(1995).“accumulation of phyllodulcin in sweet-leaf plants ofhydrangea serrata and its neutrality in the defence against a specialistleafmining herbivore.”res.popul.ecol.37(2):249-257)。在现有技术中，叶甜素如何在植物中合成以及它具有什么功能仍然是未知的。

8、因此，有一种培养特定大花绣球物种用于叶甜素工业生产的方法是非常有利的。

技术实现思路

1、因此，本发明的任务是提供一种商业大规模地培养大花绣球物种和提供植物材料用于后续加工的方法。

2、这一主要任务是通过提供一种制备干燥植物材料的方法来解决，基于该干燥植物材料的总量，该干燥植物材料具有至少2.5wt.-％叶甜素的含量，该方法包含以下步骤或由以下步骤组成：

3、a)提供大花绣球的至少一个头部和/或嫩枝插条，该大花绣球优选属于粗齿亚种，更优选选自由品种大甘茶、甘茶和天城甘茶(oamacha、amacha和amagi-amacha)、它们的杂交种和培育种组成的组，尤其是选自大甘茶、甘茶和天城甘茶(oamacha、amacha和amagi-amacha)的品种与大花绣球的任何其它变种之间的目标杂交的结果；

4、b)使该至少一个头部和/或嫩枝插条生根，优选在无固态底物的基质、无土壤的基质和/或无泥炭的基质中；

5、c)在水培、气培或雾培系统中培养至少一个生根的头部和/或嫩枝插条，并且在培养期间以每100l培养水5g至250g的给料方案，优选以每100l培养水10g至150g的给料方案通过营养液对所获得的(多株)植物施肥至少一次，该营养液包含以下或由以下组成：5wt.-％至15wt.-％氮源、2wt.-％至10wt.-％磷源、5wt.-％至25wt.-％钾源和1wt.-％至20wt.-％镁源，

6、其中，该培养是在过滤和/或遮蔽的自然光暴露情况下、或在过滤和/或遮蔽的自然光暴露伴随附加的人工照明情况下、或在人工照明情况下执行的；

7、d)在20天至200天、优选30天至120天、尤其优选40天至80天的培养期后从(多株)植物收获茎和/或叶；

8、e)在20℃至110℃的温度下、优选在30℃至70℃的温度下、尤其优选在40℃至60℃的温度下干燥所收获的茎和/或叶；

9、f)获得干燥植物材料，基于该干燥植物材料的总量，该干燥植物材料按重量计含有至少2.5wt.-％的叶甜素同等物。

10、就本发明而言的头部或嫩枝插条意指由包括发芽点的植物末端部分组成的大花绣球物种的一部分。大花绣球的嫩枝插条可以从能够繁殖(例如，具有发芽点)的植物的任何部分获得。就本发明而言重要的是，头部和/或嫩枝插条具有生根和发育独立植物的能力。

11、特别地说，物种“amagi amacha”(bot.编号1177)为在田间培养中不能良好建立、但是当用本发明的方法培养时可以在植物干物质中产生高达6wt.-％的非常高的叶甜素值的培育品种。

12、就本发明而言有利的是培养大花绣球亚种粗齿物种例如“oamacha”、“amacha”和“amagi-amacha”，但它们的杂交种和组合上文所列的不同物种作为亲本植物的目标杂交也可以用本发明的方法来培养。例如大花绣球的一个物种可以与大花绣球亚种粗齿物种“oamacha”、“amacha”和“amagi-amacha”中的任一种杂交。如本文作为大花绣球植物变种提及的植物变种“amacha”和“amagi-amacha”也被熟知为变种甜茶(thunbergii)或相应地amagiana。

13、就本发明而言，术语“生根”意指提供如下的条件：在步骤a)中提供的头部和/或嫩枝插条能够长出根。一旦插条长出根，它就被称为植物。所属领域的技术人员非常了解对应的条件以及如何实现该等条件以使根能够生长。

14、观察到特别有利的是，使步骤a)中提供的插条在无固态底物的基质、无土壤的基质和/或无泥炭的基质中生根。插条长出更多的根，该等根也长得更快，因此能够在短时间内提供一株已建立的植物。

15、就本发明而言，“培养”意指使插条或生根的植物暴露于它们生长和发展更多生物量的条件。所属领域的技术人员非常了解对应的条件以及如何实现该等条件以使得能够进行生物量生长。

16、术语“过滤和/或遮蔽的自然光暴露”优选地意指被例如玻璃或透明聚合玻璃替代品过滤的阳光，特别是从uv-b和uv-a光中过滤掉的阳光，和/或经由白色、灰色、黑色、绿色或其它颜色的遮光网被遮光单元中断的阳光。

17、“人工照明”可以例如经由传统的白炽灯、任选地过滤以减少uv-b辐射的气体放电或金属放电灯或具有各种光谱宽度的led(发光二极管)来产生。全球照射应该会产生至少50％的光合作用有效辐射(photosynthesis active radiation,par，在380nm与780nm之间)和25至800、优选50至500、特别是50至250μmol光子m-2s-1的光合光子通量密度(photosynthetic photon flux density,ppfd)。vis部分的分布可以类似于阳光或不同于具有较高的红色和/或蓝色波长比率和较低的黄色和绿色波长强度的阳光。

18、优选的是，培养是在5℃与35℃之间的日平均温度和40％至90％相对湿度下、更优选在15℃与30℃之间的日平均温度和50％至80％相对湿度下、特别优选在15℃与25℃之间的日平均温度和50％至75％相对湿度下执行。

19、“水培系统”为一种培养系统，其中，在连续暴露于液膜情况下在无泥炭的基质中培养植物，而“气培系统”为一种如下的系统：其中，在无泥炭的基质中，优选在pon中培养植物并定期供水。“雾培”系统描述了一种如下的系统：其中，在暴露于高湿度或蒸汽情况下在无泥炭的基质中培养植物。然后，经由蒸汽馏分进行植物的供水。

20、特别优选的是，在培养期间向植物供应所有必需营养素。就本发明而言，这种情况被理解为术语“施肥”。使用具有5wt.-％至15wt.-％氮源、2wt.-％至10wt.-％磷源、5wt.-％至25wt.-％钾源和1wt.-％至20wt.-％镁源的肥料(在每种情况下，基于100wt.-％肥料(＝“营养液”))，其中，术语“源”涉及可以存在于市售肥料溶液中并提供对应的元素的任何化合物。

21、以每100l培养水5g至250g的给料方案、优选以每100l培养水10g至150g的给料方案使用这种肥料。

22、在本发明的一个尤其优选的实施方案中，使用含有15wt.-％氮源、7wt.-％磷源、22wt.-％镁源和附加的6wt.-％氧化镁的15-7-22(+6)n-p-k-肥料，优选以每100l培养水65g的剂量。

23、就本发明而言的术语“收获”意指从植物中移除已长成的植物材料。收获可以是使用整株植物或基本上整株植物(以使得植物不会再生长和繁殖)，或通过仅收获植物的部分例如叶来部分进行。在一个优选的实施方案中，仅收获上部茎和叶，尤其优选仅收获植物的叶。

24、在后续干燥步骤中，干燥所收获的植物材料，优选是所收获的叶子，从而从植物材料中去除水。优选的是，所获得的干燥植物材料具有最多20wt.-％、优选10wt.-％、尤其优选最多5wt.-％的剩余水含量。测定剩余水含量的方法在所属领域中众所周知。

25、优选的是，通过干燥失重(loss-on-drying,lod)法，例如通过干燥质量平衡或热重分析法或通过卡尔·费歇尔滴定(karl fischer titration)测定水含量。

26、通常，术语“叶甜素”描述被归类为苷元的化合物。然而，在自然界中，叶甜素通常以糖苷的形式存在，其中，几种糖苷在现有技术和技术人员中是已知的。本文使用的术语“叶甜素同等物”描述苷元以及叶甜素糖苷。因此，如果要测定叶甜素同等物的量，则要考虑苷元以及叶甜素糖苷两者，每一者到目前为止都要考虑，但基于利用去糖基化的几乎自由的叶甜素来计算。

27、典型的叶甜素糖苷为例如但不限于：

28、

29、根据另一个实施方案，优选的是，术语“叶甜素同等物”描述了叶甜素对映体(和它们的糖苷)的混合物，其中，对映体(2r)-叶甜素的量高于其它对映体的每一种量，特别优选高于其它对映体的组合量。

30、一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，(多株)植物在培养期间暴露于人工应力条件、优选暴露于目标紫外光暴露和/或化学应力、尤其优选暴露于茉莉酸酯至少一次、优选数次。

31、目标紫外光暴露意指植物连续或脉冲式暴露于可见光谱(400-700nm)以及除此之外的特定质量和数量的紫外光，优选占整个发射光谱(uv加上vis，315-700nm)的1％至25％、优选2％至10％的uv-a(400-315nm)光，尤其优选在340-380nm的波长范围内，达1-100％、优选10-80％、尤其优选50-100％的培养时间。

32、术语“茉莉酸酯”一般描述来自氧脂质的组的基于脂质的植物激素(avanci nc,luche dd,goldman gh,goldman mh.jasmonates are phytohormones with multiplefunctions,including plant defense and reproduction.genet mol res.2010年3月16日；9(1):484-505)。茉莉酸酯的几种衍生物是所属领域中已知的，例如茉莉酸异构体、茉莉酸甲酯异构体、12-氧代植物二烯酸和与一些氨基酸例如亮氨酸和异亮氨酸共轭的茉莉酸异构体以及其它茉莉酸酯，广泛存在于植物界。

33、一个优选的实施方案特别涉及(-)-(3r,7r,9z)-茉莉酸、(+)-(3s,7s,9z)-茉莉酸、(+)-(3r,7s,9z)-表茉莉酸和(-)-(3s,7r,9z)-表茉莉酸和/或它们的混合物和/或它们各自的盐和/或它们各自的甲酯。

34、就本发明而言，尤其优选的是，使用茉莉酸甲酯、优选(-)-甲基-(3r,7r,9z)-茉莉酸酯或(+)-甲基-(3s,7s,9z)-茉莉酸酯或它们的混合物。

35、另一种优选的茉莉酸酯衍生物为(-)-甲基-(3r,7r,9z)-茉莉酸酯，特别是来自天然来源，例如茉莉(jasmine absolute)的提取物或精油。

36、令人惊讶地发现，茉莉酸酯的施用增加了二氢异香豆素，并且特别是收获时植物的叶中的叶甜素同等物含量。这一发现尤其令人惊讶，因为尚不知晓植物内部的二氢异香豆素和叶甜素合成的信号传导途径是哪种。

37、另一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，(多株)植物对茉莉酸酯的暴露以叶面施用形式和/或经由培养水和/或以气态形式发生。

38、“叶面施用”为通过注射器或同等合适的工具将物质直接施用到叶的方法。茉莉酸酯也可以通过简单地将期望量添加到培养水中或通过以气态形式将其提供给植物来施用。

39、一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，(多株)植物在培养期间暴露于总量为0.1mm至10mm的茉莉酸酯至少一次、优选数次。

40、又另一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，无土壤的基质和/或无泥炭的基质选自蛭石、岩棉、椰子纤维、珍珠岩、pon、seramis、火山灰、火山灰颗粒、芒草纤维、沸石、熔岩、浮岩。

41、另一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，在15℃至30℃、优选18℃至26℃的温度下培养(多株)植物。

42、又另一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，以12小时至19小时的人工光照时间至12小时至5小时的无人工光照时间、优选以15小时至17小时的人工光照时间至7小时至9小时的无人工光照时间培养(多株)植物。

43、在本发明的一个尤其优选的实施方案中，以16小时的人工光照时间至8小时的无人工光照时间培养(多株)植物。

44、一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，培养多株植物，并且其中，以最多25株植物/m2的种植密度、优选以最多20株植物/m2的种植密度培养植物。

45、另一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，在潮汐、营养膜、滴流灌溉、涓流灌溉、深水、气培或水培系统中培养(多株)植物。

46、“潮汐”系统描述了一种如下的系统：其中，植物依次暴露于来自种植托盘底部的培养水，接着过一段时间，其中，种植托盘不暴露于水。

47、“营养膜”系统描述了一种如下的系统：其中，种植托盘放在补充了营养液的连续培养水膜中。

48、“滴流灌溉”系统描述了一种如下的系统：其中，通过阀门、管道、导管和发射器的网状结构将培养水直接分布到单株植物。“涓流灌溉”系统描述了滴流灌溉系统的具体实施方案。

49、“深水”系统描述了一种如下的系统：其中，在培养水中培养植物。这意味着种植托盘放在装满培养水的槽里。

50、一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，在前一次收获后至少20天的时间后重复步骤d)至少一次，优选地其中，重复步骤d)两次、三次、四次、五次或更多次，每次在前一次收获后至少20天的时间后进行。

51、又另一个优选的实施方案涉及本发明的方法，其中，在步骤d)中收获茎和叶，并且其中，在步骤e)中干燥叶和茎材料后，将植物材料分成叶和茎材料，优选通过选自空气分离、空气浮动或筛分的方法，以获得由以下组成或包含以下的植物材料：至少75wt.-％、优选至少85wt.-％、尤其优选至少95wt.-％叶材料。

52、本发明的第二方面涉及一种干燥植物材料，该干燥植物材料优选通过本发明的方法可获得，基于该干燥植物材料的总量，该干燥植物材料具有至少2.5wt.％、优选至少3wt.％、特别优选至少4wt.％叶甜素同等物的含量，且/或其中，基于该干燥植物材料的总量，该干燥植物材料包含小于2.0wt.％、优选小于1.5wt.％、更优选小于1wt.％、特别优选小于0.5wt.％绣球酚同等物，优选地其中，该干燥植物材料由叶组成或主要由叶组成。

53、通常，术语“绣球酚”描述被归类为苷元的化合物。然而，在自然界中，绣球酚通常以糖苷的形式存在，其中，几种糖苷在现有技术和技术人员中是已知的。另外，绣球酚也可以以开链型式存在，即所谓的绣球花酸或其糖苷。本文使用的术语“绣球酚同等物”描述苷元以及绣球酚糖苷。因此，如果要测定绣球酚同等物的量，则要考虑苷元以及绣球酚糖苷两者，每一者到目前为止都要考虑，但基于利用去糖基化的几乎自由的绣球酚来计算。

54、典型的绣球酚糖苷为例如但不限于：

55、

56、优选的是，术语“绣球酚”仅描述上述苷元。在这种情况下，如果要测定绣球酚的量，则仅考虑苷元(如存在)。

57、一个优选的实施方案涉及本发明的干燥植物材料，其中，该干燥植物材料具有小于20wt.％、优选小于10wt.％的残留水分，这取决于该干燥植物材料的总量。