本发明涉及的是农作物组织培养，具体涉及一种利用分子标记的辣椒快速培育方法。
背景技术：
1、分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是dna水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，dna分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的dna都可用于标记分析；分子标记揭示来自dna的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，dna分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
2、辣椒是一种重要的蔬菜作物，为一年或有限多年生草本植物，辣椒味道辛辣、刺激性强，具有很好的开胃功能，同时辣椒中含有丰富的维生素c、维生素b、胡萝卜素以及钙、铁等矿物质含量也比较丰富，具有杀菌、防腐、调味、营养驱寒等功能，对人们防病、治病等起了积极作用。据农业部大宗蔬菜体系统计，近年来我国辣椒年播种面积占全国蔬菜总播种面积的8%～10%，居蔬菜首位。辣椒是贵州省最重要的特色农业产业之一，主要集中在遵义、毕节等市县。
3、目前，贵州辣椒的种植规模、加工业规模、产品集散规模等均居全国第一，辣椒现已成为影响贵州农业生产结构调整，影响农民收入的重要蔬菜种类，辣椒已经成为农业种植户作为主要的经济作物之一来进行种植。由于辣椒的需求量较大，因而对辣椒的种植量每年都在增加。辣椒的种植方法主要是播种育苗，经移植栽培后，容易出现死苗、叶片发黄、缓苗时间长及不生长等现象，导致其整体成活率不高。按照现有常规方法辣椒最终的产量和品质得不到很好的提升，为了促进辣椒的种植推广范围，需要对现有的种植方法进行改进，因此，辣椒脱病毒苗的培育就显得尤为重要。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是针对背景技术中存在的问题，采用辣椒果实为外植体，在无菌条件下，通过组织培养技术，直接培育成苗，从而建立植物无菌苗体系，可大大缩短培育时间，能在短期内可获得大量无菌苗，减少死苗现象，提高其整体成活率，从而达到提高其产量，满足市场需求，具体地说是一种利用分子标记的辣椒快速培育方法。
2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种利用分子标记的辣椒快速培育方法，所述培育方法包括有种子的采集与处理、诱导培养、增殖培育、生根培育、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率，具体包括以下步骤：
3、s1、种子的采集与处理：采集辣椒果实后取出种子，并将种子用清水浸泡，并进行消毒，再用乙醇浸泡，然后用无菌水冲洗，备用；
4、s2、诱导培养：将s1步骤中得到的种子，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无菌的诱导培养基中，在温度为25±1℃，光照时长为8～12h/d，光照强度2800～3500lx条件下的光照培养箱中培养，诱导出不定芽；
5、s3、增殖培育：将s2步骤获得的不定芽用无菌手术刀切分为单株，每株保留2～3片叶片；在无菌环境下接种到增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长8～12h/d，光照强度2800～3500lx条件下的光照培养箱中培养，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育；
6、s4、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽用无菌手术刀剪下后浸泡于iba溶液中，每株保留3～4片叶片，选择长势较好的单株苗在无菌环境下，接种到生根培养基中诱导生根，在温度为25±1℃，光照时长8～12h/d，光照强度2800～3500lx条件下的光照培养箱中培养，培养一周后得到健壮的生根苗；
7、s5、炼苗、染色体加倍和移栽：将步骤(4)得到的生根苗连同培养容器一同移出光照培养箱，将生根后的辣椒组培苗放在正常室温房间中，在室温条件下放置炼苗5～10天后，将植株从培养基中取出，并去除苗根部的培养基，并用秋水仙素溶液浸泡根系进行染色体加倍，最后移栽于带有泥土的栽培箱中；
8、s6、倍性鉴定：将步骤s5得到的栽培苗培养20天后，取新生叶片进行倍性鉴定，获得纯合二倍体；
9、s7、利用分子标记检测病毒的脱毒率：提取组培辣椒苗全基因组dna，以所述基因组dna为模板，利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应得到pcr扩增产物，通过pcr扩增筛选出符合目标要求的纯合植株。
10、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中在所述s1步骤中，采集辣椒果实后取出种子，先将种子用40～45℃的清水浸泡2～3天，然后用0.1～0.2％高锰酸钾溶液进行消毒5～8min，再用75～80％的乙醇浸泡8～12s，最后用无菌水冲洗3～5次即可。
11、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中在所述s2步骤中，所述诱导培养基选择添加有1～3mg/l三十烷醇、0.05～0.1mg/lkt(激动素)和0.05～0.1mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂。
12、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其特征在于：在所述s3步骤中，所述增殖培养基选择添加有2～4mg/l2 ,4-d(2，4-二氯苯氧乙酸)、0.5～1mg/l6-ba(6-苄氨基嘌呤)和0.05～0.1mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂。
13、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中在所述s3步骤中，所述继代培养的方法是将长出的嫩芽剪下转入至增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长8～12h/d，光照强度2800～3500lx条件下的光照培养箱中进行继代培养2～4次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为7～10天。
14、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中在所述s4步骤中，所述生根培养基选择添加有0.5～1mg/l iba(吲哚丁酸)和1.0～1.5mg/liaa(吲哚乙酸)的1/2ms培养基，其中1/2ms培养基包含有质量浓度为1.5%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂。
15、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中在所述s5步骤中，所述染色体加倍处理为将炼苗5～7天后的小苗取出，清洗根部的培养基，用浓度为0.2～0.4％的秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍。
16、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中在所述s6步骤中，所述倍性鉴定采用流式细胞仪，以正常二倍体辣椒为对照，剔除单倍体和多倍体植株。
17、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中在所述步骤s7中，利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应时，其中所述正向引物的核苷酸序列为：5’-ctgtgatatggaaggggaacc-3’，而所述反向引物的核苷酸序列为5’-aactcgctgggaaaagaatg-3’。
18、进一步地，本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，其中所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养基均在121℃温度下灭菌30分钟，并在灭菌前调整其ph值为5.6～5.8。
19、采用本发明所述培育方法，培养基中的ms培养基为植物组织培养技术中常用基本培养基配方，具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
20、三十烷醇是天然生物产品，其可增强淀粉酶、多氧化酶、过氧化物酶活性；还能促进发芽、生根、增强抗寒、抗旱能力，和其它激素相比，加入三十烷醇可以促使愈伤组织变绿，并提高植株愈伤组织诱导率。
21、kt的中文名为激动素/6-糠基氨基嘌呤，植物细胞分裂素的一种，是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糖基氨基嘌呤(或n6-呋喃甲基腺嘌呤)，其分子式c10h9n5o。不溶于水，溶于强酸、碱及冰醋酸中；除具有促进细胞分裂的作用外，还具有延缓离体叶片和切花衰老，诱导芽分化和发育及增加气孔开度的作用。
22、naa的中文名为萘乙酸，植物生长素的一种，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
23、iba的中文名吲哚丁酸，是植物生长素的一种，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成，被广泛应用于树木和花卉的扦插生根。
24、iaa的中文名吲哚乙酸，是植物生长素的一种，用作刺激植物生长的激素类试剂，广泛应用于农业生产中。
25、6-ba的中文名苄基嘌呤/6-苄基氨基嘌呤，是植物细胞分裂素的一种，具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质分解,保绿防老;氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能,广泛用农业、树和园艺作物从发芽收获各阶段。
26、2 ,4-d的中文名2，4-二氯苯氧乙酸，是一种植物生长调节剂，可以促进插条生根，果实早熟，防止落花落果等作用。
27、采用本发明所述的利用分子标记的辣椒快速培育方法，与现有技术相比，其有益效果在于：可以不受季节、温度和地域影响，快速培育大量的辣椒无菌苗，能够有效提升辣椒的生长发育速度，提升了辣椒的产量，进而改善了种植栽培的效益，极具市场竞争力，适合于大规模培育，同时，通过在短期内繁殖大量种苗，利用分子标记，筛选出符合目标要求的纯合植株，可为贵州辣椒种质资源创制提供数据支撑，另外，通过对辣椒无菌繁殖体系的建立，并为后续研究贵州辣椒主要风味物质的分析和鉴定，以及贵州辣椒风味的遗传解析及辣椒风味改良的分子育种提供理论基础和技术支持具有重要意义。
28、实施方式
29、为了更充分的解释本发明的实施，以下结合具体实施例来进一步说明本发明。所举实例只用于解释本发明，而不是限定本发明的范围。
30、本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均可实现本发明，涉及的技术方案，如未特别说明，均可采用本领域的常规技术。
31、实施例
32、一种利用分子标记的辣椒快速培育方法，所述培育方法包括有种子的采集与处理、诱导培养、增殖培育、生根培育、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率，具体包括以下步骤：
33、s1、种子的采集与处理：采集辣椒果实后取出种子，先将种子用40℃的清水浸泡2天，然后用0.1％高锰酸钾溶液进行消毒5min，再用75％的乙醇浸泡8s，最后用无菌水冲洗3次，备用；
34、s2、诱导培养：将s1步骤中得到的种子，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无菌的诱导培养基中，在温度为25±1℃，光照时长为8h/d，光照强度2800～3000lx条件下的光照培养箱中培养，诱导出不定芽；所述诱导培养基选择添加有1mg/l三十烷醇、0.05mg/lkt(激动素)和0.05mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂，在ms培养基中添加有三十烷醇、kt(激动素)和naa(萘乙酸)，通过三十烷醇与kt(激动素)和naa(萘乙酸)的结合，能有效的促进了辣椒细胞生长、分化的能力，使得细胞生长速度快、组织代谢旺盛，抗逆性强；
35、s3、增殖培育：将s2步骤获得的不定芽用无菌手术刀切分为单株，每株保留2～3片叶片；在无菌环境下接种到增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长8h/d，光照强度2800～3000lx条件下的光照培养箱中培养，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育，所述继代培养的方法是将长出的嫩芽剪下转入至增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长8h/d，光照强度2800～3000lx条件下的光照培养箱中进行继代培养2～4次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为7～10天；所述增殖培养基选择添加有2mg/l2 ,4-d(2，4-二氯苯氧乙酸)、0.5mg/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤)和0.05mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂；
36、s4、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽用无菌手术刀剪下后浸泡于iba溶液中，每株保留3～4片叶片，选择长势较好的单株苗在无菌环境下，接种到生根培养基中诱导生根，在温度为25±1℃，光照时长8～12h/d，光照强度2800～3500lx条件下的光照培养箱中培养，培养一周后得到健壮的生根苗；所述生根培养基选择添加有0.5mg/l iba(吲哚丁酸)和1.0mg/liaa(吲哚乙酸)的1/2ms培养基，其中1/2ms培养基包含有质量浓度为1.5%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂；
37、s5、炼苗、染色体加倍和移栽：将步骤(4)得到的生根苗连同培养容器一同移出光照培养箱，将生根后的辣椒组培苗放在正常室温房间中，在室温条件下放置炼苗5天后，将植株从培养基中取出，并去除苗根部的培养基，清洗根部的培养基，用浓度为0.2％的秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，最后移栽于带有泥土的栽培箱中；
38、s6、倍性鉴定：将步骤s5得到的栽培苗培养20天后，取新生叶片进行倍性鉴定，获得纯合二倍体；所述倍性鉴定采用流式细胞仪，以正常二倍体辣椒为对照，剔除单倍体和多倍体植株；
39、s7、利用分子标记检测病毒的脱毒率：提取组培辣椒苗全基因组dna，以所述基因组dna为模板，利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应得到pcr扩增产物，通过pcr扩增筛选出符合目标要求的纯合植株；其中在利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应时，所述正向引物和反向引物均为现有引物，所述正向引物的核苷酸序列为：5’-ctgtgatatggaaggggaacc-3’，而所述反向引物的核苷酸序列为5’-aactcgctgggaaaagaatg-3’。
40、实施例
41、一种利用分子标记的辣椒快速培育方法，所述培育方法包括有种子的采集与处理、诱导培养、增殖培育、生根培育、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率，具体包括以下步骤：
42、s1、种子的采集与处理：采集辣椒果实后取出种子，先将种子用42℃的清水浸泡3天，然后用0.15％高锰酸钾溶液进行消毒6min，再用78％的乙醇浸泡10s，最后用无菌水冲洗4次，备用；
43、s2、诱导培养：将s1步骤中得到的种子，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无菌的诱导培养基中，在温度为25±1℃，光照时长为12h/d，光照强度3000～3300lx条件下的光照培养箱中培养，诱导出不定芽；所述诱导培养基选择添加有2mg/l三十烷醇、0.08mg/lkt(激动素)和0.08mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂，在ms培养基中添加有三十烷醇、kt(激动素)和naa(萘乙酸)，通过三十烷醇与kt(激动素)和naa(萘乙酸)的结合，能有效的促进了辣椒细胞生长、分化的能力，使得细胞生长速度快、组织代谢旺盛，抗逆性强；
44、s3、增殖培育：将s2步骤获得的不定芽用无菌手术刀切分为单株，每株保留2～3片叶片；在无菌环境下接种到增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度3000～3300lx条件下的光照培养箱中培养，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育，所述继代培养的方法是将长出的嫩芽剪下转入至增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度3000～3300lx条件下的光照培养箱中进行继代培养2～4次，至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为7～10天；所述增殖培养基选择添加有3mg/l2 ,4-d(2，4-二氯苯氧乙酸)、0.8mg/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤)和0.08mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂；
45、s4、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽用无菌手术刀剪下后浸泡于iba溶液中，每株保留3～4片叶片，选择长势较好的单株苗在无菌环境下，接种到生根培养基中诱导生根，在温度为25±1℃，光照时长12h/d，光照强度3000～3300lx条件下的光照培养箱中培养，培养一周后得到健壮的生根苗；所述生根培养基选择添加有0.8mg/l iba(吲哚丁酸)和1.2mg/liaa(吲哚乙酸)的1/2ms培养基，其中1/2ms培养基包含有质量浓度为1.5%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂；
46、s5、炼苗、染色体加倍和移栽：将步骤(4)得到的生根苗连同培养容器一同移出光照培养箱，将生根后的辣椒组培苗放在正常室温房间中，在室温条件下放置炼苗7天后，将植株从培养基中取出，并去除苗根部的培养基，清洗根部的培养基，用浓度为0.3％的秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，最后移栽于带有泥土的栽培箱中；
47、s6、倍性鉴定：将步骤s5得到的栽培苗培养20天后，取新生叶片进行倍性鉴定，获得纯合二倍体；所述倍性鉴定采用流式细胞仪，以正常二倍体辣椒为对照，剔除单倍体和多倍体植株；
48、s7、利用分子标记检测病毒的脱毒率：提取组培辣椒苗全基因组dna，以所述基因组dna为模板，利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应得到pcr扩增产物，通过pcr扩增筛选出符合目标要求的纯合植株；其中在利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应时，所述正向引物和反向引物均为现有引物，所述正向引物的核苷酸序列为：5’-ctgtgatatggaaggggaacc-3’，而所述反向引物的核苷酸序列为5’-aactcgctgggaaaagaatg-3’。
49、实施例
50、一种利用分子标记的辣椒快速培育方法，所述培育方法包括有种子的采集与处理、诱导培养、增殖培育、生根培育、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率，具体包括以下步骤：
51、s1、种子的采集与处理：采集辣椒果实后取出种子，先将种子用42℃的清水浸泡2天，然后用0.2％高锰酸钾溶液进行消毒8min，再用80％的乙醇浸泡12s，最后用无菌水冲洗5次，备用；
52、s2、诱导培养：将s1步骤中得到的种子，用无菌滤纸吸干表面水分，接种到无菌的诱导培养基中，在温度为25±1℃，光照时长为10h/d，光照强度3200～3500lx条件下的光照培养箱中培养，诱导出不定芽；所述诱导培养基选择添加有3mg/l三十烷醇、0.1mg/lkt(激动素)和0.1mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂，在ms培养基中添加有三十烷醇、kt(激动素)和naa(萘乙酸)，通过三十烷醇与kt(激动素)和naa(萘乙酸)的结合，能有效的促进了辣椒细胞生长、分化的能力，使得细胞生长速度快、组织代谢旺盛，抗逆性强；
53、s3、增殖培育：将s2步骤获得的不定芽用无菌手术刀切分为单株，每株保留2～3片叶片；在无菌环境下接种到增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长10h/d，光照强度3200～3500lx条件下的光照培养箱中培养，然后再将长出的嫩芽剪下转入增殖培养基中进行继代增殖培育，所述继代培养的方法是将长出的嫩芽剪下转入至增殖培养基中，在温度为25±1℃，光照时长10h/d，光照强度3200～3500lx条件下的光照培养箱中进行继代培养2～4次，直至获得继代培养组织，其中，每次继代培养的时间为7～10天；所述增殖培养基选择添加有4mg/l2 ,4-d(2，4-二氯苯氧乙酸)、1.0mg/l 6-ba(6-苄氨基嘌呤)和0.1mg/l naa(萘乙酸)的ms培养基，其中ms培养基包含有质量浓度为3%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂；
54、s4、生根培育：将增殖培育长出的嫩芽用无菌手术刀剪下后浸泡于iba溶液中，每株保留3～4片叶片，选择长势较好的单株苗在无菌环境下，接种到生根培养基中诱导生根，在温度为25±1℃，光照时长10h/d，光照强度3200～3500lx条件下的光照培养箱中培养，培养一周后得到健壮的生根苗；所述生根培养基选择添加有1.0mg/l iba(吲哚丁酸)和1.5mg/liaa(吲哚乙酸)的1/2ms培养基，其中1/2ms培养基包含有质量浓度为1.5%的蔗糖，质量浓度为6g/l的琼脂；
55、s5、炼苗、染色体加倍和移栽：将步骤(4)得到的生根苗连同培养容器一同移出光照培养箱，将生根后的辣椒组培苗放在正常室温房间中，在室温条件下放置炼苗7天后，将植株从培养基中取出，并去除苗根部的培养基，清洗根部的培养基，用浓度为0.4％的秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，最后移栽于带有泥土的栽培箱中；
56、s6、倍性鉴定：将步骤s5得到的栽培苗培养20天后，取新生叶片进行倍性鉴定，获得纯合二倍体；所述倍性鉴定采用流式细胞仪，以正常二倍体辣椒为对照，剔除单倍体和多倍体植株；
57、s7、利用分子标记检测病毒的脱毒率：提取组培辣椒苗全基因组dna，以所述基因组dna为模板，利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应得到pcr扩增产物，通过pcr扩增筛选出符合目标要求的纯合植株；其中在利用分子标记的正反向引物进行pcr扩增反应时，所述正向引物和反向引物均为现有引物，所述正向引物的核苷酸序列为：5’-ctgtgatatggaaggggaacc-3’，而所述反向引物的核苷酸序列为5’-aactcgctgggaaaagaatg-3’。
58、采用本发明所述的培育方法，其中所述实施例1至3中的诱导培养基、增殖培养基和生根培养基均在121℃温度下灭菌25分钟，并在灭菌前调整其ph值为5.6～5.8。
59、为了说明采用本发明所述培育方法的培育情况，采用遵义朝天椒为外植体，在无菌条件下，通过组织培养技术，筛选出符合目标要求的纯合植株，通过室外栽培，其最终移栽存活率达到98%以上。
60、以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用以限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。