一种慢阻肺炎症大鼠模型的建立方法及其应用

本发明涉及动物模型构建，具体为一种慢阻肺炎症大鼠模型的建立方法及其应用。

背景技术：

1、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，copd，简称慢阻肺)是全球性患病率、致残率和病死率高的重大疾病。慢性炎症反应是copd发展进程的核心环节，临床以糖皮质激素抗炎、支气管扩张剂解痉、抗生素等为主的常用治疗方式，易产生依赖性、反复发作等问题，且并不能有效阻止肺功能的持续下降。中医药在治疗copd面发挥了重要作用，认为肺气虚证是copd等肺系疾病发生发展的根本因素，病情迁延，久病伤气，则肺肾气虚，致肺失治节，肾失封藏，血液不循常道而成瘀，津液代谢失常则成痰饮，血瘀、痰浊、水饮交错为患。早期病位在肺，随病程发展，以肺气虚证为主证的证候逐步演变为肺脾气虚证、肺肾气虚证。本技术构建与人类肺肾气虚证相似的实验动物模型，对各组大鼠进食情况、毛发、呼吸、体重、大小便等临床表征、大鼠肺功能检测、he染色及透射电镜观察肺组织病理等，以明确药物在治疗慢阻肺上的医药用途和药理作用。

技术实现思路

1、本发明所解决的技术问题在于提供一种构建与人类肺肾气虚证相似的实验动物模型，以研究六味补气方在治疗慢阻肺上的医药用途和药理作用，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种慢阻肺炎症大鼠模型的建立方法，以研究六味补气方在治疗慢阻肺上的医药用途和药理作用，六味补气方中的中药为人参、黄芪、益智仁、玉竹、陈皮和肉桂，包括以下步骤：

3、步骤一：选择spf级sd大鼠60只，鼠龄5～8周，体质量180±20g，随机分为正常组、肺肾气虚证模型组、六味补气方治疗组，每组大鼠20只；

4、步骤二：肺肾气虚证模型组和六味补气方治疗组中的大鼠采用烟熏联合lps气管滴注及强迫游泳、激素注射，用于复制copd肺气虚证大鼠模型；

5、步骤三：给药方法，lps气管滴注后，每日造模后，六味补气方治疗组按4.95g/kg剂量灌胃给药，每日1次，其给药剂量依据临床等效剂量换算而来，直至造模结束，正常组大鼠及肺肾气虚证模型组大鼠给予等体积的生理盐水灌胃。

6、所述步骤二中复制copd肺气虚证大鼠模型的具体操作方法为；

7、(1)将大鼠每天烟熏前置于恒温水槽(43±1℃)中强迫游泳30分钟，以耗伤其肺气，后置于自制的烟熏箱内，燃烧50g锯末和10支香烟进行烟熏，每天烟熏1次，每次烟熏30min，共烟熏28天；

8、(2)第1天、14天通过手术暴露气管，每只大鼠气管滴入200μl lps(1mg/ml)，当天不烟熏，于第22天开始，改为每天烟熏3次，并于背部皮下连续注射氢化可的松琥珀酸钠0.3ml/只每天(25mg/ml)，每日一次，共给予8天。

9、一种慢阻肺炎症大鼠模型的应用，通过六味补气方调控copd炎症免疫网络的关联分子机制，包括以下方面：

10、(1)大鼠宏观情况检测分析，以明确六味补气方对应的干预各证候copd大鼠的作用；

11、(2)肺-肠轴微生态群检测，以明确肺-肠轴特定微生态群和六味补气方的调节特征；

12、(3)免疫细胞群及细胞因子检测，阐明六味补气方调控肺-肠轴特定菌群与炎症免疫改善的相关性；

13、(4)关键代谢通路分子检测，六味补气方发挥功效所靶向的关键免疫代谢途径；

14、(5)针对单细胞测序研究所得的结果进行相关分析；

15、(6)流式细胞术检测balf中m1标志物cd80、cd86表达和m2标志物cd163、cd206表达；

16、(7)采用免疫组化染色检测肺组织m1标志物cd80、cd86、inos表达和m2标志物cd163、cd206、arg-1表达；

17、(8)检测大鼠am内m1标志物cd80、cd86、inos表达盒m2标志物cd163、cd206、arg-1的表达；

18、(9)wb检测大鼠肺泡am内m1标志物cd86、inos蛋白的表达和m2标志物cd163、cd206、arg-1蛋白的表达；

19、(10)根据scrna-seq所获得的巨噬细胞调控相关基因研究六味补气方介导肺泡巨噬细胞极化调控肺-肠轴微生态变化靶向copd炎症免疫的相关路径；

20、(11)采用co-ip技术明确固本培元方(六味补气方)基于方证对应所靶向的关键分子间的相互作用；

21、(12)回复实验，验证六味补气方对应调控copd炎症免疫网络的关联分子机制和调控肺-肠微生态轴与炎症免疫网络的关联分子机制，进一步为六味补气方的辨证施治策略提供依据。

22、作为本发明进一步方案：所述大鼠宏观情况检测分析，结合证候要素观察六味补气方对各组大鼠进食情况、毛发、呼吸、体重、大小便等临床表征、大鼠肺功能检测、he染色及透射电镜观察肺组织病理等，明确六味补气方对应的干预作用。

23、作为本发明进一步方案：所述肺-肠轴微生态群检测，取大鼠肺泡灌洗液和肠道内容物用于提取dna，经dna的完整性检验后，取合格样品进行16srdna扩增、测序，分析生物多样性，并结合宏基因组高通量测序技术，进行cog、kegg等功能注释分析，明确肺-肠轴特定微生态群移植和六味补气方对copd肺-肠轴微生态群的调节特征。

24、作为本发明进一步方案：所述免疫细胞群及细胞因子检测，采用单细胞测序结合空间转录组技术分析大鼠肺泡灌洗液样本和肺组织及肠道组织中的免疫细胞群，筛选组间差异免疫细胞群，分析大鼠肺泡灌洗液的免疫细胞群改变及其差异转录本，采用elisa技术检测外周血及肺泡灌洗液中细胞因子的表达，明确六味补气方对copd肺部免疫细胞群的调控作用，并联合wgcna分析获取关联靶微生态群与免疫细胞群的关键分子与通路，以阐明六味补气方调控肺-肠轴特定菌群与炎症免疫改善的相关性。

25、作为本发明进一步方案：所述关键代谢通路分子检测，采用qpcr技术检测大鼠肺组织中关键通路代谢分子转录水平的表达；采用westernblot结合免疫组化技术检测大鼠肺组织中关键蛋白的表达，了解六味补气方对所靶向关键代谢通路分子表达的影响及组织定位。

26、作为本发明进一步方案：所述针对单细胞测序研究所得的结果进行相关分析，包括以下方面：

27、(1)对组间巨噬细胞亚群基因差异表达及细胞功能变化进行分析，研究各组大鼠巨噬细胞极化特征及分子机制；

28、(2)对巨噬细胞进行细分亚群，并对子亚群进行rna速率分析和拟时分析，探究不同巨噬细胞分型的分化途径和分化方向，找出不同分化状态的巨噬细胞功能的变化规律与六味补气方治疗copd炎症之间的关系；

29、(3)对巨噬细胞与其他免疫细胞、巨噬细胞子亚群间进行细胞通讯分析，探究免疫细胞间、巨噬细胞子亚群间的相互作用及分子间的相互作用，研究六味补气方治疗过程中的巨噬细胞的细胞动态及免疫细胞间的相互关系。

30、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本技术通过六味补气方对应调控copd炎症免疫网络的关联分子机制和调控肺-肠微生态轴与炎症免疫网络的关联分子机制，为六味补气方的辨证施治策略提供依据。以重大疾病中医优势阶段的高发证候为切入点，立足临床需求，在前期临床研宄的基础上，运用scrna-seq、cba、宏基因组等多种技术方法从调控copd肺肾气虚证大鼠肺部免疫微环境和肺泡巨噬细胞极化的角度探讨六味补气方通过调控肺部微生态，改善气道免疫炎症的分子机制，并通过体外实验进一步研究与验证了其作用机制作用，全面探索了巨噬细胞在copd发病中的作用机制及六味补气方对其调控作用。有助于阐明“固本培元”理论的科学内涵，旨在突破copd慢性炎症和气流受限的治疗瓶颈，研究目标明确，具有创新性思路。